[发明专利]一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷的方法

说明书

本发明公开了一种制备玉米赤霉烯酮‑葡萄糖苷的方法，该方法包括如下步骤：以ZEN和UDP作为底物，HvUGT14077为催化酶，20‑40℃反应5～10分钟，甲醇或者乙腈终止反应，制备得到ZEN‑G。本发明首次建立了体外同时制备两种玉米赤霉烯酮‑葡萄糖苷(ZEN‑14G及ZEN‑16G)的方法；方法简单快捷，转化率为99.18％。

技术领域

本发明涉及农产品和食品安全领域，具体地说涉及一种制备玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(Zearalenone-glucoside，ZEN-G)的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由镰孢属真菌产生的类雌激素毒素，严重危害人畜健康。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)调查研究显示，ZEN在以谷物小麦、大麦、玉米等为基础的食物和饲料中普遍存在。玉米赤霉烯酮-葡萄糖苷(zearalenone-glucoside，ZEN-G，包括ZEN-14G和ZEN-16G两种)是在植物脱毒过程中，ZEN在糖苷转移酶的作用下的葡萄糖苷化产物。

ZEN-G已被证明常与ZEN共存饲料及各种农产品中。近来研究发现ZEN-G可以在生物体的消化道内水解而释放出原型毒素ZEN从而产生毒性，对人畜健康具有较大的潜在风险。因此，ZEN-G的检测、代谢和毒理等研究已成为焦点和热点。

开展ZEN-G的相关研究，必须用到大量的标准品。但目前还未有商业化的ZEN-G标准品，严重制约了其各项研究。目前，ZEN-G的制备方法主要有化学合成法和生物转化法两种，但均费时费力且产量不高。因此，建立一种简单快捷的大量制备ZEN-G的方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备ZEN-G(ZEN-14G和ZEN-16G)的方法，该方法包括如下步骤：

以ZEN和大麦二磷酸尿苷葡萄糖(UDP)作为底物，大麦二磷酸尿苷葡萄糖(UDP)-糖基转移酶(HvUGT14077)为催化酶，30-40℃反应5～10分钟，甲醇或者乙腈终止反应，制备得到ZEN-G。

具体的说，该方法包括如下步骤：

配置反应液，其中ZEN的浓度为15-20μmol/L、HvUGT14077的浓度为0.5-1mg/mL、UDP的浓度为5-10mmol/L，30-40℃反应5-10min；

用甲醇或乙腈终止反应后，离心去除蛋白沉淀，即得ZEN-G；

然后利用LC-MS/MS检测ZEN-G的含量；同时运用基质加标进行实际玉米样品的检测。

其中HvUGT14077的合成方法为：

重组表达载体的构建：全基因合成大麦二磷酸尿苷葡萄糖-糖基转移酶HvUGT14077基因，克隆入pET22b-MBP，构建重组表达载体；

重组酶的表达纯化：载体转入大肠杆菌BL21，接种于LB培养基，25-40℃培养至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1～1mmol/L，10-30℃诱导表达10-30小时，利用Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化得到。其中HvUGT14077是作为制备ZEN-G的催化酶。

具体的说，HvUGT14077是通过如下方法制备得到的：

1)全基因合成获得大麦UDP-糖基转移酶HvUGT14077的基因序列，5’端引入酶切位点BamH1，3’端引入酶切位点EcoR1。通过酶切和连接，将HvUGT14077基因克隆入表达载体pET22b-MBP中，得到重组表达载体。将所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建含有重组表达载体的工程菌。