[发明专利]一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法

说明书

本发明提供一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，包括脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞上清液获取、间充质干细胞因子的分离纯化、间充质干细胞因子冻干粉制备。本发明采用了无血清培养体系培养人脐带间充质干细胞，避免了FBS中动物源成分对皮肤的刺激。此外，本发明采用单一样本来源，ELISA法测定蛋白浓度准确，保证批次产品均一性。使用细胞工厂作为培养载体，模拟体内低氧环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高产量。再者，采用低温冻干技术，使产品可在常温下保存，方便运输，且有限延长干细胞旁分泌因子活性保存期限。

技术领域

本发明属于生物技术领域，一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调控、促进造血干细胞归巢、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能，因此具有广泛的应用前景。

随着对间充质干细胞研究的不断深入，其作用机理也越来越清晰明确，主要有3方面：1、间充质干细胞旁分泌作用。2、间充质干细胞替代或修复死亡或受损的组织细胞。3、细胞直接接触，调控细胞。越来越多的研究表明，间充质干细胞旁分泌作用在其发挥治疗效果中起主要作用。脐带间充质干细胞在培养过程中可分泌多种细胞因子，如表皮生长因子(EGF) ，血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子(HGF)，基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、肿瘤坏死因子(TNF)，神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、白介素6（IL-6）等。间充质干细胞所分泌的因子具有改善细胞生长微环境、调节机体免疫、促进血管再生、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等功能，对受损皮肤、敏感皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，能促进胶原蛋白合成，延缓衰老等。

将细胞旁分泌因子提纯浓缩后添加到美容化妆品中，是化妆品行业发展的新趋势。含细胞旁分泌因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在韩国和日本，细胞旁分泌因子化妆品尤为甚行。但市面上的细胞旁分泌因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入化妆品基质的方式生产，细胞旁分泌因子含量低，均一性差，稳定性差，美容护肤抗衰效果一般。

目前技术缺陷：现有技术是用普通培养瓶培养间充质干细胞，并收集合并多代细胞培养上清液，并对上清液进行过滤得到细胞旁分泌因子。该方法得到的间充质干细胞旁分泌因子含量低，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，且多代收集的方法制备细胞旁分泌因子，产品均一性较难保证。此外，该方法制备所得细胞旁分泌因子为液态，常温下易降解，需低温保存，加大保存和运输难度。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种细胞旁分泌因子产量高、均一性好、稳定性好，易保存和运输的人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种细胞旁分泌因子产量高、均一性好、稳定性高的人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

1、脐带间充质干细胞分离制备和鉴定

（1）取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端20cm，置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；