[发明专利]一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞上清液获取、间充质干细胞因子的分离纯化、间充质干细胞因子冻干粉制备。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述的脐带间充质干细胞分离制备和鉴定方法为：

（1）取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端20cm，置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；

（2）将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去1cm长度，丢弃；再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块；将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次；将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通胶；用生理盐水充分洗涤华通胶3次，后将其剪碎成1mm³～3mm³大小组织块；将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5％的CO₂的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的T175培养瓶中培养后进行传代。

3.根据权利要求2所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：其中储运液为40ml的α-MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B 5ug/ml；无血清完全培养基为：体积浓度为2%血清替代物和体积浓度为1% GlutaMAX™-I，其余为LONZA无血清培养基。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞上清液获取：将检测合格的细胞按3~5×10⁴/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5% CO₂的培养箱中进行扩增培养；当扩增培养的细胞长至细胞融合度70%-80%时，调整参数为37℃、5% CO_2、5% O₂继续培养，24h后调整参数为37℃、5% CO_2、15% O₂，48h后收集半量上清液，并向细胞工厂内补充等量新鲜无血清培养基，调整参数为37℃、5% CO_2、5% O₂继续培养，72h后收集细胞上清液。

5.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣；将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液；将去沉渣后的滤液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管中，4℃，4000g离心1.5-2h；收集浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存；将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，进一步浓缩1.5-2h ；弃掉超滤管下面的液体；加盐水重复超滤离心洗涤一次，收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。

6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：间充质干细胞因子冻干粉制备为：将间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液用生理盐水稀释，用注射器抽取浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌，加入终浓度10wt.％甘露醇、2wt.%海藻糖、3 wt.%右旋糖酐、2 wt.%人血白蛋白、0.2 wt.%甘氨酸、2 wt.%氨基乙酸和0.4wt.%抗坏血酸的冻存保护剂，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到人源间充质干细胞旁分泌因子冻干粉。