[发明专利]一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法

说明书

本发明公开了一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法，包括锈菌夏孢子的制备、离体叶片的制备和接种鉴定；其中锈菌夏孢子的制备包括接种培养盒的制备、采集具有典型咖啡锈菌病斑的咖啡发病叶片上的锈菌夏孢子，并将锈菌夏孢子涂在感病品种的叶片背面，重复接种获得纯化锈菌株系。本发明中的咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法，可以确保每份待鉴定种质材料的接种条件、接种压力和发病条件高度一致，最大限度的降低因接种环境和发病环境不一致造成的实验误差，提高了鉴定结果的准确性，此外离体接种鉴定摆脱了大田鉴定对季节的依赖，使抗锈病鉴定能够随时开展，大大提高了工作效率。

技术领域

本发明涉及抗病育种技术领域，更具体的说是涉及一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法。

背景技术

由咖啡锈菌(Hemileia vastatrix Berk.&Br.)引起的咖啡锈病是咖啡(Coffeaarabica)生产上普遍发生的一种病害，严重威胁我国咖啡的产量和品质，每年造成咖啡的产量损失在15％～80％之间。该病在全世界咖啡生产区均有发生，主要危害咖啡叶片、造成叶片脱落、植株衰弱、甚至死亡。由于咖啡锈病是气传病害，很难用化学防治和生物防治等手段根除，选育抗病品种是防治咖啡锈病最经济有效的方法。

但是，目前对咖啡锈病的鉴定主要采用田间自然鉴定和接种鉴定的方法，通过田间自然发病或人工接种锈病夏孢子，发病后调查叶片病斑症状及产孢情况，据此进行分级，最后根据各种质病情级别评价其抗锈病的能力，这种方法虽然简单、快速，但受田间气候变化的影响较大，接种成功与否均难以控制，且调查时分级困难，鉴定结果的准确性也无法保证。获得抗锈病种质资源、挖掘抗病基因是抗锈育种的前提和基础，而可靠的抗锈菌鉴定技术是实现这一目标的关键。为了提高抗锈病鉴定的准确性，在小麦、大豆上相继建立了离体叶片鉴定的方法，但在咖啡上，尚无锈病离体鉴定的方法与技术。

因此，建立一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种咖啡种质锈病抗性的离体鉴定方法，该方法采用经在离体咖啡嫩叶上接种纯化的锈菌单一生理小种，在可控的环境下观察锈菌夏孢子的生长情况，根据孢子的生长状况评价种质的抗锈病能力。该技术操作简单，易于应用，且离体接种鉴定摆脱了大田鉴定对季节的依赖性，使抗锈病鉴定能够根据研究者的需要随时开展，大大提高了工作效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、一种用于咖啡锈病抗性离体鉴定的锈菌夏孢子，其特征在于，所述锈菌夏孢子的制备方法如下：

1)接种培养盒的制备：用浓度为70～75％的酒精浸泡海绵3～5分钟，后晾干，铺在塑料培养盒底部，用无菌水将海绵浸湿；

2)采集具有典型咖啡锈菌病斑的咖啡发病叶片，刮下锈菌夏孢子，并将所述锈菌夏孢子涂在感病品种Caturra或Matari的叶片背面，使所述锈菌夏孢子均匀分布，并喷上水雾至有水膜产生；然后将接种叶片背面朝上，置于所述接种培养盒内的海绵上，20～25℃暗培养40-50h，之后明暗交替培养35～40天；

3)将所述接种叶片上出现的单个锈菌夏孢子堆，接种在新的Caturra或Matari叶片上，重复步骤2)和步骤3)2～3次，获得纯化的锈菌株系；

4)取出产孢叶片，将所述锈菌夏孢子收集后放入胶囊，在相对湿度为45-55％的干燥器内干燥，后5℃保存。

进一步地，步骤2)中所述感病品种Caturra或Matari的叶片为刚刚展开，幼嫩柔软的叶片。刚刚展开，幼嫩柔软的叶片生长不够健壮而比较嫩弱，抵抗力差，容易感染上锈菌，利用幼嫩柔软的叶片作为感染基体，相较于成熟健壮的叶片，增加了接种成功率，并且缩短了感染时间，有利于加快纯化锈菌株系的筛选。