[发明专利]生物反应芯片及其制备方法

说明书

本发明提供一种生物反应芯片及其制备方法，包括：提供一微腔芯片，所述微腔芯片包括基底及形成于所述基底内的多个反应单元；首先于所述基底的平台面及所述反应单元的内侧壁形成亲水涂层；然后采用湿法化学修饰或转印的方法于所述基底的表面形成疏水涂层，以得到各反应单元内反应液体互不串扰的生物反应芯片。本发明通过基底平台面的疏水处理及反应单元内壁的亲水处理消除各反应单元的串扰；同时，工艺步骤简单，上样率高达95％以上，可以顺利检测到荧光信号，提高dPCR检测结果的可靠性，并且微腔式芯片便于保存，可随时进行复查分析。

技术领域

本发明涉及数字PCR生物检测领域，特别是涉及一种生物反应芯片及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。1985年问世以来，PCR技术经历了定性(终点PCR)、相对定量(实时定量PCR，Real-time PCR，简称qPCR)和绝对定量(数字PCR，简称dPCR)三个阶段。

作为第二代PCR技术，qPCR技术已发展成为一种最普遍应用的定量分析技术，广泛应用于临床疾病诊断、检验检疫、食品安全等领域。qPCR的分析结果高度依赖循环阈值(Cycle threshold，Ct值)，而Ct值又由PCR效率决定。当样本中检测靶标纯度、浓度很低时，会显著降低qPCR的反应效率和成功率。qPCR是一种相对定量的检测技术，当前主要应用在待测样本需要相对定量的场合，在检测低频稀有突变、微小表达差异(小于1.5倍)、微量核酸样本时，qPCR通常无法成功。qPCR通常是利用移液枪将反应体系分布在96或384孔板中，经过后续扩增与荧光信号检测完成实验。单个孔的反应体积一般在微升级别，受到移液枪和其他相关系统精度的限制，在少量样本的分析中面临挑战。Fludigm的微流控芯片可将每个反应液滴体积降至纳升级别，显著降低了检测限度。然而该芯片制备过程复杂，成本高昂，且对于常见分析，微升级别的反应体系已经能满足其分析精度要求。

作为第三代PCR技术，dPCR技术近年来迅猛发展。其将DNA溶液分散至皮升至纳升的微量反应体系中，每个反应体系的DNA模板数至多1个；在PCR循环反应之后，根据发出荧光信号的微量反应体系所占有的比例来判定原始DNA浓度。dPCR不依赖于Ct值，不受扩增效率的影响，因此具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。因此，该技术灵敏度高、特异性强、检测通量高、定量准确，可广泛应用于临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面。

dPCR需要提供的反应空间比qPCR要多得多以及小得多，提供可靠、高质量、高密度的反应单元是dPCR的核心。当前主要通过微流控芯片和微腔式芯片等分液方法实现。微流控芯片利用微滴发生器一次生成数万至数百万个油包水微滴，但其微流控芯片易堵塞，且液滴容易相互融合。微腔式液滴分割技术通过在基底上制备出阵列微孔作为反应单元(芯片)，对试剂的兼容性较高，且不会发生液滴的融合现象。PCR反应液在微腔反应单元内的加载方式可采用微流控或刮涂方式完成，后者成本较低、简单易行，但对芯片要求更高，具体要求如下：1.微腔反应单元需要具有一定的高密度满足dPCR计算结果的可靠性；2.微孔基材对PCR过程没有抑制作用；3.样本在芯片上较高的加载效率和加载稳定性，同时消除样本在微孔间平台上的停留，避免反应单元间的串扰。

现有技术中提出了一些芯片处理方法，但是普遍工艺复杂、上样率低，不适合于大规模批量应用。因此，提出一种零串扰、开发成本低、工艺步骤简单、上样率高、适合大批量稳定生产的适用于生物反应的高密度芯片以及芯片表面处理方法是芯片式dPCR快速推广和应用的首要条件。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物反应芯片及其制备方法，用于解决现有技术中生物反应芯片开发成本高、工艺步骤复杂、上样率低等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种生物反应芯片的制备方法，所述生物反应芯片的制备方法至少包括：