[发明专利]一种抗菌肽混合物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种来源于鸡蛋溶菌酶的抗菌肽混合物及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述抗菌肽混合物的制备方法，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物。本发明利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解，其酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较鸡蛋溶菌酶的抑菌活性提高了40％，其抗菌活性显著提升，扩大了鸡蛋溶菌酶的应用范围；本发明提供的制备工艺具有简单、快速、高效的特点，适合工业化生产。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种来源于鸡蛋溶菌酶的抗菌肽混合物及其制备方法和应用。

背景技术

随着细菌对抗生素耐药性和抗生素的残留问题日益严重，研究和开发新型抗菌药物已经成为世界性的研究课题，大量研究表明，中草药提取物、微生物制剂、酶制剂、益生元、抗菌肽、酸化剂等具有抑菌作用。其中，溶菌酶来自动物体内，因为其同源性和高效性而备受人们亲睐。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

迄今为止，生产上应用最多的是鸡蛋清溶菌酶(hen egg white lsozyme)。鸡蛋清中溶菌酶的含量很丰富，约占蛋清总蛋白的3.4％-3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是结构了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129个氨基酸，分子量约为14,300Da，富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸，可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。鸡蛋清溶菌酶具有的广谱抗性使其在食品和医学等领域早已得到广泛地应用。

在大自然有许多种类的生物能制造具有抗菌能力的肽作为先天性免疫对抗外来病原菌的第一道防线。目前在昆虫、哺乳动物、植物中均有发现抗菌肽。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的碱性多肽物质，可以快速查杀靶标，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。由于抗菌肽为天然产物，迅速成为潜在的治疗药物。抗菌肽的治疗范围为：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等。

抗菌肽分子量比溶菌酶分子量小，更具开发成药物的潜力。溶菌酶本身作为蛋白质，可以进一步被酶解为小分子多肽，如何通过酶解获得具有抗菌活性的小分子多肽是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于从鸡蛋溶菌酶中获取具有抗菌活性的小分子多肽，进而提高溶菌酶的抗菌效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗菌肽混合物的制备方法，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物。

本发明研究表明，相较于中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶，通过碱性蛋白酶酶解获得的多肽的抗菌活性显著提高。

所述碱性蛋白酶购自江苏锐阳生物科技有限公司，酶活性20万U/g，分子量分布如图2所示。该酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。

作为优选，碱性蛋白酶相对鸡蛋溶菌酶的添加量为0.06-1g/g。先将鸡蛋溶菌酶以质量百分比为1-5％的浓度溶于水中，调节pH后，加入质量百分比0.3-5％的碱性蛋白酶。酶解体系以水为反应介质，避免其他物质的掺杂，提高食品安全性。