[发明专利]一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明提供了一系列麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体，应用于制备海藻糖，具有比较好的效果。本发明还将麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体在E.coli BL21(DE3)中进行了表达、发酵优化酶，可显著提高酶的产量。

技术领域

本发明涉及一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性二糖，同时具有高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。自1995年以来，日本、美国和欧盟等先后批准海藻糖可以用作食品添加剂。2005年，我国卫生部正式批准海藻糖为新资源食品。

1993年日本林原生化研究所首次发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以液化淀粉作为底物，这两种酶协同作用，可以生成海藻糖，并且率先实现了海藻糖工业化生产。目前，我国已有公司开始生产海藻糖，但产品性能、产率与进口产品存在一定差距，并且生产成本一直居高不下。更为严峻的是，为了迎合市场需求，海藻糖售价不断下降，给海藻糖生产带来了巨大挑战和压力。因此如何提升海藻糖产率，实现海藻糖低成本规模化制备，使其走向大众消费者的餐桌成为学术界和产业界关注的热点。

目前，工业化生产海藻糖主要通过两种方法：①利用海藻糖合成酶，以麦芽糖作为底物，通过分子内转糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作为底物，经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖。两种方法生产海藻糖产率相近，但是，从生产成本以及周期考虑，以淀粉作为底物制备海藻糖，工艺更为简便，成本更为低廉。因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖，更具优势。

国内外双酶法生产海藻糖包括中低温酶系(来源菌包括Arthrobacter sp.Q36、Arthrobacter ramosus S34、Brevibaterium helvolum等)和高温酶系(来源菌包括Sulfolobus solfataricus KM1和Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909等)。高温酶系通常具有较高的海藻糖转化率，并且具有良好的热稳定性，能在较高温度下转化淀粉生成海藻糖，不容易在生产过程中污染杂菌。但是，高温酶系相对于中低温酶系，蛋白表达量低，不利于其工业化应用。

发明内容

基于上述现状，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活，为其工业化生产创造条件。

本发明提供了具有酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的突变体，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140、202、218、323、338或404位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖水解酶相比，酶活提高。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码所述来源于嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M140L。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，突变体命名为L202P。