[发明专利]一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M140L；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，突变体命名为L202P；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为L218D；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为Y323G；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为F338S；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，同时第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到L202P/Y323G；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，同时第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到L202P/L218D/Y323G；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，同时第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，同时第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S；

或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶的第140位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，第202位置的亮氨酸(Leu)变成脯氨酸(Pro)，第218位置的亮氨酸(Leu)变成天冬氨酸(Asp)，第323位置的酪氨酸(Tyr)变成甘氨酸(Gly)，第338位置的苯丙氨酸(Phe)变成丝氨酸(Ser)，同时第404位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，得到M140L/L202P/L218D/Y323G/F338S/I404T。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或重组细胞。

4.制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清液即为突变体麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。

5.一种生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，将表达权利要求1所述突变体的重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，37℃培养8～14h，以0.1g·L^-1·h^-1的流速流加乳糖，并在30℃诱导10～20h。