[发明专利]一种纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法

说明书

本发明属于医药领域，涉及到单克隆抗体纯化技术，具体公开了一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法。本发明通过将离子交换层析过程中加入添加剂，并用盐调节电导显著改善了层析性能，提高了蛋白质量，降低蛋白浊度。通过本发明的技术方案，可使得目的蛋白纯度达到了99.7％以上，同时酸碱异构体、其他杂质成分和含量很好的控制在抗体的质量要求之内。本发明操作简单，成本低廉，安全性高，可用于工业化大规模生产。

技术领域

本发明属于医药领域，涉及到单克隆抗体的纯化技术，具体涉及一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法。

背景技术

CD20是非糖基化的跨膜磷酸蛋白，表达在大多数成熟B细胞表面，分化为浆细胞后，CD20消失。研究表明它可以起到钙离子通道的作用，参与B细胞分化、发育的调节。而在B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达量异常增高，与在抗体结合后，CD20不被内在化或从细胞膜上脱落。CD20的上述特点使其成为利用单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的理想靶抗原。针对这一优势，开发研制了一种抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体，其在与B细胞淋巴瘤表面的抗原结合后，可通过激活补体介导的细胞溶解及细胞毒作用从而破坏和清除肿瘤细胞。

采用重组技术，应用CHO细胞表达系统，可以获得大规模的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体，但细胞环境的多样性和培养细胞补料的加入使得获得的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体中的杂质多样，主要包括宿主残留蛋白(HCP)核酸、酸碱异构体等，微量的杂质都会在人体内产生免疫反应，因此必须使抗体中的杂质成分和浓度控制在抗体的质量要求之内。杂质的去除适于纯化阶段，优化纯化工艺，提高纯化效率在抗体类药物生产中至关重要。

抗体药物的制造又以下游工艺最为复杂繁琐。下游工艺包含多个步骤，目前常用的是亲和层析、疏水层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析的液相色谱分离方法。虽然都是采用这几种层析方法，但是具体的参数不同、填料选择不同都会产生完全不同的效果。

层析方法中粗纯的亲和层析柱可以通过抗体与Fc融合蛋白吸附的特异性从而吸附目的抗体而除去90％以上的细胞上清中的杂质，因此在蛋白A亲和层析之后还需要进行多维纯化的工艺优化。针对于亲和层析获得的抗体CD20人鼠嵌合单克隆抗体异构体、DNA的残留多等问题，对其后续的阳离子阴离子层析进行工艺优化，以求获得高质量的抗体，保证用药安全。

CN105017418A公开了一种单克隆抗体的纯化方法，(1)亲和层析，(2)调亲和层析洗脱液的pH至3.3～3.8，进行病毒灭活，(3)调节pH至中性深层过滤，(4)阴离子交换层析，(5)阳离子交换层析。通过该方法可使得目的蛋白SEC纯度达到99.6％。CN105263947A公开了一种单克隆抗体的纯化工艺，包括离心过滤和深层过滤随后再调节进行细胞分离和净化培养物上清液，亲和层析，低pH温育，中和再调节，疏水层析，超滤-渗滤，阴离子交换柱层析，纳滤、超滤、渗滤、微滤等过程；其中的抗体包括抗CD20抗体。该方法用到的疏水层析需要高浓度盐上样，盐浓度太高容易影响蛋白的结构活性，使得目的蛋白变性或沉淀，同时无法考虑酸碱异构体的去除。针对现有工艺中经过亲和层析获得的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体含有多种杂质，影响其药效及临床用药安全，很有必要提供一种步骤简单且蛋白纯化效果更好的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的纯化方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种离子交换法纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法，发明人经过研究，发现采用阳离子层析和阴离子层析相结合，并优化了层析条件，可有效去除抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体中的微量杂质，从而提高了抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的质量和稳定性。本发明的技术方案如下：

一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

(1)对亲和层析获得的样品加入添加剂，调节pH5.0～6.0；

(2)对步骤(1)得到的样品进行阳离子层析；