[发明专利]多肽的制备方法

说明书

本发明涉及一种制备多肽或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；2)用裂解液裂解肽树脂，得到粗肽；3)采用碘氧化法对粗肽直接进行二硫键环化反应。所述制备方法适用于大规模制备所述多肽，制备规模可达百克到千克级。

技术领域

本发明涉及多肽的制备方法，特别是一种抗肿瘤多肽ATAP-M8的大规模制备方法。

背景技术

ATAP-M8是从Bfl-1(氨基酸147-175)衍生的一个新型的双亲尾锚多肽，和在很多肿瘤细胞表面高表达的整合素受体(Integrin)高结合的iRGD结构序列融合，经结构修饰得到的融合多肽。它可有效的识别癌细胞与正常细胞，定向将多肽带入到肿瘤细胞区域，特异性杀死肿瘤细胞而降低对正常细胞的损伤。ATAP-M8是一个全新的多肽类抗癌药物，能特异性识别细胞线粒体膜，经特殊的双亲螺旋结构定位在线粒体膜上打孔，物理性破坏线粒体结构，诱导细胞凋亡。

ATAP-M8含有38个氨基酸残基，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其C末端的氨基酸(Cys)羧基为酰胺化结构，N末端的氨基酸(Lys)氨基为乙酰化结构，第30和38位的半胱氨酸巯基间生成分子内二硫键。

多肽的化学合成分为液相和固相两种方法，其中液相法适合小肽的合成，对于长肽，固相法是目前普遍采用的多肽合成方法。固相肽合成反应的原理是，将多肽序列C端的第一个氨基酸的羧基，通过缩合反应固定在不容性的载体(树脂)上，然后脱除氨基保护基，再与过量的活化后的第二个氨基酸的羧基反应，形成肽键。重复脱保护，缩合，洗涤过程，将肽链按顺序延长，最后获得所需长度的多肽序列。固相合成完成后，通过三氟乙酸将肽链从树脂上裂解下来，并同时脱除所有的侧链保护基团，再经高效液相色谱纯化，即得所需多肽。固相合成的优点是合成中最费时费力的纯化步骤，均以简单的洗涤和过滤完成，大大减轻纯化难度，具有方便快捷，操作简便和易于实现自动化的优势。

ATAP-M8由于其较长的氨基酸序列，以及活性构象α-螺旋和分子内二硫键的存在，常规的固相合成方法不能实现对其大规模的合成。

发明内容

本发明涉及ATAP-M8的大规模制备方法。该方法可制备百克级和千克级批次的ATAP-M8纯肽。应用该方法制备的ATAP-M8多肽，纯度98.5％，可作为抗肿瘤药物临床研究的原料药。

本发明涉及一种制备SEQ ID NO.1所示多肽或其药学上可接受的盐的方法，

其中：C末端的半胱氨酸(C)羧基为酰胺化结构，N末端的赖氨酸(K)氨基为乙酰化结构，在氨基酸序列位置30和38的两个Cys(C)残基之间形成分子内二硫键，

包括以下步骤：

1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；

2)用裂解液裂解肽树脂，得到粗肽；

3)采用碘氧化法对粗肽直接进行二硫键环化反应，在氨基酸序列位置30和38的两个Cys(C)残基之间形成形成分子内二硫键。

在一个实施方案中，本发明所述的制备方法，其中，在步骤3)中对所述粗肽进行以下操作：

使用乙腈和醋酸的混合溶剂溶解粗肽，得到粗肽溶液；

向粗肽溶液中加入水，得到稀释液；

搅拌中向稀释液中逐滴加入碘甲醇溶液。

优选地，所述混合溶剂中，乙腈和醋酸的体积比为0.5～1.5:1，优选为0.8～1.2:1，更有选为0.9～1.1:1，进一步优选为1:1；