[发明专利]一种激活酶催化反应的双功能小分子化合物及其应用

说明书

本发明涉及催化反应，具体的说是一种激活酶催化反应的双功能小分子化合物及其应用。双功能小分子化合物为被至少一个催化基团取代的C_5‑10羧酸、C_5‑10氟代羧酸、芳杂环取代的羧酸、杂环取代的羧酸、C_5‑10羧酸酰胺衍生物、C_5‑10氟代羧酸酰胺衍生物、芳杂环取代的羧酸酰胺衍生物或杂环取代的羧酸酰胺衍生物，其中，所述羧基或酰胺衍生物作为锚定基团。本发明方法的建立既可以使引入的催化基团数量不受限制，又可以实现催化功能基团的取向以及与活性中心距离的精细调控。这样可以更好的增强H₂O₂活化效率，提高催化活性及立体选择性。

技术领域

本发明涉及催化反应，具体的说是一种激活酶催化反应的双功能小分子化合物及其应用。

背景技术

细胞色素P450酶具有十分重要的应用价值，它可以催化各种不同类型的化学反应，如羟基化，环氧化，氮、氧、硫部位上的脱烷基化，氮、硫等杂原子的氧化，氧化性的脱氨、脱卤及C-C键断裂等一系列反应。尤其是选择氧化惰性C-H键在有机合成方面有巨大潜力，应用P450酶开发手性药物生物合成技术已成为当前国内外研究热点。

细胞色素P450BM3作为P450酶超家族一员，因其超高的催化效率和成熟高效的表达系统，对其研究和应用十分广泛，已在医药中间体制备等领域有良好应用。但是P450BM3和绝大多数P450酶一样，其催化过程中都需要辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶I，NADH)或者还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型辅酶II，NADPH)提供两个电子，经由还原伴侣蛋白传递到反应活性中心，与来自蛋白质外部的两个质子一道，还原活化氧分子而生成反应活性中间体compound I，由后者负责底物氧化^[1]。昂贵的辅因子和复杂的电子传递体系导致了其体外催化的低效，制约其在生物化工和有机合成上的进一步应用。

虽然在P450的催化循环中有过氧化氢支路(H₂O₂ shunt)的存在，但也仅有少数P450酶(如属于CYP152亚族的一些酶)可以利用此一催化途径^[2,3]。由于过氧化氢路径不需要辅因子NAD(P)H和还原伴侣蛋白(酶)，可极大地简化催化路径，提高催化效率。另外过氧化氢价格便宜、反应中仅生成水作为副产物具有环境友好性，因此开发基于过氧化氢的P450酶催化体系可以极大地释放P450酶在生物化工和有机合成上的应用潜力。鉴于P450-H₂O₂催化体系的巨大潜在应用价值，尽管由于蛋白结构上的原因，绝大多数P450酶不能直接利用过氧化氢作为氧源。科学家已经尝试利用定点突变和定向进化的方法构建过氧化氢依赖的P450过加氧酶(Peroxygenase)。研究发现BMP-F87A可以利用过氧化氢羟化肉豆蔻酸，最高催化活性可达162nmol/min/nmol P450^[4]；F87V可以将吲哚转化为靛蓝(Indigo)^[5]。Cirino等^[6]以F87A为模板用定向进化技术得到的突变体21B3，把对硝基酚氧基月桂酸的氧化活性提高18倍。尽管定点突变和定向进化的策略在P450-H₂O₂人工催化体系开发中取得一定进展，但其催化活性普遍较低。主要还是因为无论野生型P450酶还是其突变体，在活性中心部位都缺乏类似天然过氧化物酶和过加氧酶中可以起到“酸-碱”催化作用的氨基酸残基，而正是这样的氨基酸残基担负了过加氧酶催化过程中活化过氧化氢的任务。科学家也曾尝试利用定点突变在P450的活性部位引入这样的氨基酸残基，然而催化效果并不理想。这是因为只有引入的氨基酸残基与活性中心保持适当距离，才能真正起到“酸-碱”催化剂的作用，从而实现P450对过氧化氢的利用。例如，P450BM3的三个单点突变体F87H、F87D和F87E中，仅有F87H显示较低的过氧化氢催化活性，F87D和F87E则完全没有活性，就是由于该位点距离血红素铁离子活性中心过近^[7,8]。