[发明专利]基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用。针对原本只能应用于无性繁殖作物的外源基因清除技术，改进外源基因清除技术的基础载体，采用效应载体与激活载体组成的双载体形式，将效应载体和激活载体分别作用于不同亲本。效应载体包括标记基因表达框1、重组酶识别序列和重组酶表达框；激活载体包括标记基因表达框2、重组酶识别序列和激活表达框；分别含有效应载体的和含有激活载体的两亲本杂交时，实现特定组织和/或时期中将全部外源基因的清除，使该技术能够应用于有性繁殖作物中的异交繁殖作物，生物安全性高，具有良好的研究和应用前景。

技术领域

本发明应用于解决转基因植物生态安全及食品安全的问题，属于转基因育种技术领域，具体涉及一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用。

背景技术

人们对于转基因植物的安全性主要有两方面的忧虑：一是转基因植物的外源基因可能会通过花粉和种子在种群之间扩散，从而影响生态环境和生物多样性。二是转基因食品可能对人体的健康有不良影响。为解决转基因植物生态安全及食品安全的问题和担忧，目前国内外已经发表了以下几种技术：

(1)花粉不育技术

由于基因漂移主要是通过花粉和种子进行，花粉不育技术可消除由花粉引起的外源基因的逃逸。虽然花粉不育技术可以用于某些无性繁殖的植物，但不能直接用于水稻、玉米等有性繁殖的大田作物。花粉不育可使这些收获种子的作物颗粒无收。同时，花粉不育技术也不能解决种子引起的基因扩散和转基因食品安全等问题。

(2)无籽技术

种子扩散是外源基因逃逸的另一条重要途径。通过利用特异性启动子与IaaM基因融合，可获得无籽烟草、无籽茄子[5]和无籽瓜果[6]。无籽技术可防止由种子引起的外源基因逃逸，也可大幅度地提高很多瓜果类作物的产量和质量。但该技术同样不能用于水稻、玉米等有性繁殖的大田作物。

(3)“终结者”技术

“终结者”技术是美国Delta and PineLand公司研究并经美国专利局1998年3月批准的一项专利[7]，但从未有公开发表的实验数据支持该技术的实际可行性和效果。从理论上讲，该技术可解决转基因植物的外源基因通过种子的扩散问题。“终结者”技术是把一个休眠的种子自杀的基因插入到转基因作物，休眠的自杀基因可以通过化学调控被激活，使农民收获的种子不能正常萌发。由于该技术使农民无法将自收的种子用于来年播种和生产，因此遭到世界各地农民和许多发展中国家的反对[8]。早在1998年，国际农业促进基金会(RAFI)就明确要求美国政府禁止使用终结者技术。另一方面，虽然“终结者”种子技术的概念很好，但根据我们的经验和知识，它的效率会较低，沒有大田的实际应用价值。

(4)叶绿体转化技术

由于大部分植物的花粉不含叶绿体，外源基因整合进叶绿体基因组后，不会像核基因组那样随花粉转移而扩散到坏境中。因而，将外源基因整合到叶绿体基因组可减轻由花粉引起的外源基因漂移问题。目前，虽然叶绿体转化已在烟草等多种植物上取得成功，但还存在转化周期长、同质化难度大等问题。而且，该技术还不能在许多重要作物上使用[9]。有研究还发现，在一些裸子植物和被子植物(如松树、苜蓿、烟草和水稻等)的花粉中含有叶绿体[10,11]。另外，叶绿体基因组中的基因仍存在着渗透现象[12]。转移频率依赖于混合群体的大小、时间长短及它们之间的杂交频率。并且，叶绿体转化不能阻止由种子引起的外源基因扩散问题以及转基因作物的食品安全问题。

(5)无标记基因技术

转基因植物带有的抗生素和除草剂抗性标记基因使一些人担心它们对环境和人畜健康的不利影响。利用共转化、转座子、同源重组、位点特异重组酶删除标记基因等方法可以获得无标记基因的转基因植物。其中的一些技术已相当成熟，并被应用到已商品化的转基因作物上。尽管如此，无标记基因等技术并不能解决抗虫、抗草甘膦等外源基因环境和食品安全性的问题。