[发明专利]一种用于鉴定茶花品种的方法

说明书

本发明提供一种用于鉴定茶花品种的方法，涉及园林、园艺技术领域，本发明提供的分子特异性标记引物可对山茶花品种怒江山茶进行快速的鉴别，特别地，本发明还提供用于检测山茶花品种的检测方法，所述方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别山茶花品种所不能替代的分子手段，本发明提供的检测方法可以从根本上解决山茶花在园林、园艺应用中品种、亚种之间“同名异物”、“同物异名”现象，给园林、园艺植物的应用、推广以及新品种选育提供分子水平上的检测方法以及技术支持。

技术领域

本发明涉及园林技术领域，特别地涉及山茶花品种“怒江山茶”的分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对山茶花品种“怒江山茶”进行快速鉴定的方法。

背景技术

茶花品种大约有2000种，可分为3大类，12个花型，2013年中国茶花品种已有306个以上。《花镜》记载茶花品种有十九个：玛瑙茶、鹤顶红、宝珠茶、蕉萼白宝珠、杨妃茶、正宫粉、石榴茶、一捻红、照殿红、晚山茶、南山茶等。茶花型多，有单瓣、半重瓣、重瓣、曲瓣、五星瓣、六角形、松壳型等。

我国山茶花属植物资源丰富，分布广泛，且山茶花属植物表型具有较强可塑性，种间杂交容易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态分类很难快速、准确有效评价与区分。学术界对目前山茶花品种的名称和描述都很混乱，“同物异名”或“同名异物”现象较为严重，缺乏统一规范的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此亟需建立一个科学合理的山茶花品种分类鉴定系统以帮助山茶花在园林艺术领域有长足发展。

本发明提供一种用于鉴定茶花品种怒江山茶的方法，从分子水平上建立该品种的特异的DNA指纹标记，以便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，为山茶花在园林、园艺领域发展提供分子生物学支持。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种怒江山茶的分子特异性标记引物及检测方法。

本发明是以如下技术方案实现的：本发明提供一种用于鉴定茶花品种的方法，所述方法包括提取待测山茶花品种组织的基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现600-800bp的特异DNA条带，则待测山茶花品种为怒江山茶，反之则否。

进一步地，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现712bp的特异DNA条带，则待测山茶花品种为怒江山茶。

进一步地，所述山茶花DNA提取包括如下步骤：步骤一、取待检测山茶花品种新鲜幼嫩叶片2g，迅速放入2mL Eppendorf管中，置于液氮罐中预冷；步骤二、将样品从液氮罐中取出，放入预冷的研钵中，在研钵中不断倒入液氮将叶片磨成细粉；步骤三、迅速将研磨好的细粉装入2mLEppendorf管中，加入900μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀；步骤四、将Eppendorf管置于55℃水浴中，保温60min，其间不时颠倒混匀；步骤五、待冷至室温后，加入500μL氯仿/异戊醇，颠倒混匀至溶液呈乳浊状，6000rpm离心5min分层；步骤六、用剪去端部约0.5cm的2mL吸头小心将上层液相转移至另一Eppendorf管中；步骤七、加入600μL异丙醇，颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现；步骤八、4℃，12000rpm离心10min沉淀DNA，去上清，依次用800μL76%乙醇、0.2mol/L乙酸钠和1mL 70%乙醇洗涤沉淀；步骤九、沉淀干燥后溶于加有3μL RNaseA的50μL TE中，4℃过夜或直接置于-20℃；步骤十、通过紫外分光光度计将DNA浓度调至1μg/μL，备用，如果在步骤九后溶液颜色过深或明显混浊应重复步骤八，进行二次抽提，加入2% PVP，PVP对抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性有很好的效果。