[发明专利]重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组溶瘤腺病毒Onco^Ad‑P28GANK‑E1A‑△E1B及其构建方法和其在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明还公开了一种肝癌特异性P28GANK启动子及其筛选方法和在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明的P28GANK启动子具有高效的肝癌特异性，用其构建获得的重组溶瘤腺病毒Onco^Ad‑P28GANK‑E1A‑△E1B毒性低、抗肝癌效果好，且抗肝癌效果优于重组溶瘤腺病毒GP73‑E1A‑△E1B。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是关于一种重组溶瘤腺病毒Onco^Ad-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用。

背景技术

肝癌是全球第五大常见的恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率的特点，在肿瘤致死原因中排第三位，严重危害人类的生命健康和安全。肝癌的发病机制复杂，尚未完全清楚。目前临床上治疗肝癌一般采用介入治疗、化疗、外科手术、放疗及联合治疗等方式，这些传统方式主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。对于中晚期的癌症患者来说，这些传统的方法难以奏效，急需新的治疗手段来延长患者的生命，提高他们的生活质量。全球肝癌统计数据发现，男性的肝癌发生率要高于女性，在发展中国家，肝癌致死率排名第二，而我国的肝癌发生率和死亡率占全球的一半，因此，我们亟需寻找新的癌症治疗方法。

靶向基因-病毒治疗策略，以溶瘤病毒为载体，携带抗癌基因，利用其在肿瘤细胞内特异性增殖，裂解，成千上万倍的提高抗癌基因的表达量。该策略克服了基因治疗靶向性低，转染效率低等的缺点，充分利用溶瘤病毒复制转移能力强，体积小的优势，进一步提高抗肿瘤的效果。

中国专利文献CN103981185A公开了一种肝癌特异性GP73核心启动子，通过筛选该启动子具有高效的肝癌特异性，同时，该文献还公开了携带GP73启动子靶向肝癌腺病毒载体GD55的构建和应用，所获得的双靶向腺病毒GD55-gene溶瘤腺病毒能选择性的杀死肿瘤细胞，而不影响正常细胞，因此能有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。为此，发明人尝试开发新的靶向药物，以期获得更高效和更稳定的疗效，为肝癌的治疗找到新的方向和启示。

P28GANK又称P28，Gankyri，PSMD10，是一种由226个氨基酸组成，分子量为25kDa的蛋白质。经研究，这种蛋白是人26S蛋白酶体调节亚单位19S/PA700复合物中的一种非ATP酶亚基。最初，P28GANK是通过cDNA文库经过消减杂交法克隆而得到的一个在肝癌细胞中差异表达的基因，P28GANK蛋白在哺乳动物中高度保守，它能介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用，从而发挥多种生物学功能。

P28GANK基因在肝癌细胞中呈特异性的高表达状态，Fujita等人对肝癌患者样品进行mRNA表达检测，发现P28GANK的mRNA的表达水平在肝癌组织中比癌旁组织高出3.4倍(Higashitsuji,H.,et al.,Reduced stability of retinoblastoma protein bygankyrin,an oncogenic ankyrin-repeat protein overexpressed in hepatomas.NatMed,2000.6(1):p.96-9)。王红阳等对64例肝癌样本进行了Northern blot检测，结果显示，P28GANK在肝癌细胞中检出率高达96.9％，表达明显升高的样本占了91.9％，P28GANK蛋白同时在肝硬化组织中也有一定水平的表达，但是在正常的细胞中，没有检出P28GANK的表达。同时王红阳等在HepG2、HuH-7、SK-Hep-1、Hep3四种肝癌细胞中均检测到了该基因的高表达(Fu,X.Y.,et al.,Overexpression of p28/gankyrin in human hepatocellularcarcinoma and its clinical significance.World J Gastroenterol,2002.8(4):p.638-43)。

发明内容