[发明专利]重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 201810097442.0 | 申请日： | 2018-01-31 |
| 公开（公告）号： | CN110093323A | 公开（公告）日： | 2019-08-06 |
| 发明（设计）人： | 章康健;刘新垣;方先龙;顾锦法 | 申请（专利权）人： | 上海元宋生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/861;C12N15/113;A61P35/00;C12R1/01 |
| 代理公司： | 上海华工专利事务所(普通合伙) 31104 | 代理人： | 缪利明;赵孟琴 |
| 地址： | 201415 上海市奉贤区沪*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 溶瘤腺病毒 肝癌 构建 制备治疗肝癌 启动子 应用 筛选 | ||
1.一种重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B，其特征在于，所述重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B如SEQ ID NO：19所示的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，腺病毒基因组敲除了E1B基因区域。
2.一种如权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以PGL3-F4质粒为模板，采用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点Xhol到SnabI的核酸片段，即P28GANK启动子片段；
步骤二、以pZXC2质粒为模板，采用如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点SnabI到Xbal的核酸片段，即P-E1A基因片段；
步骤三、以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，采用如SEQID NO：8和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行Overlap PCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal的核酸片段，即P28GANK-E1A片段；
步骤四、将Overlap PCR得到的P28GANK-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，然后与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-pSur-E1A-△E1B质粒相连接，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B；
步骤五、将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B重组质粒用限制性内切酶PmeI线性化，去磷后转化到带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态中，使二者发生同源重组，筛选并获得阳性重组克隆的腺病毒质粒；
步骤六、将阳性重组克隆的腺病毒质粒用限制性内切酶PacI线性化，转染入人胚胎肾细胞株HEK-293，获得重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
3.一种如权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B在制备治疗肝癌药物中的应用。
4.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B。
5.一种肝癌特异性P28GANK启动子，其特征在于，所述肝癌特异性P28GANK启动子为如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示的序列。
6.如权利要求5所述的肝癌特异性P28GANK启动子，其特征在于，所述肝癌特异性P28GANK启动子为如SEQ ID NO：19所示的序列。
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