[发明专利]基于荧光染料TOTO-1分析检测PARP-1活性的方法

说明书

本发明公开了一种基于TOTO‑1荧光染料分析检测PARP‑1活性的方法。所述方法步骤如下：(1)激活DNA、PARP‑1(多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶‑1)、NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，PARP‑1催化合成带大量负电荷的PAR聚合物(聚ADP‑核糖)；(2)得到的产物用ExoIII切除双链。释放出PAR；(3)将TOTO‑1(噻唑橙二聚体‑1)与产物PAR聚合物作用，利用荧光光谱仪对产物溶液进行检测。本发明利用TOTO‑1与产物PAR聚合物结合后产生的荧光信号的增强作用，观察荧光信号强度变化，可用于检测PARP‑1酶。本发明具有简便、快速、灵敏度高、而且无需标记DNA探针的优点。

技术领域

本发明属于一种定量检测PARP-1(多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1)活性的技术，通过TOTO-1与PAR的吸附作用，引起TOTO-1荧光信号的增强，检测荧光信号实现在临床检测的应用，具体涉及TOTO-1荧光染料定量检测生物酶的应用领域。

背景技术

PARP，也称聚ADP核糖聚合酶，是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，这个家族包含18种酶，其中PARP-1含量最高，是一种在正常生理活动和疾病的发生发展中都起关键作用的细胞功能调节剂。在基因稳定和肿瘤的发生发展、炎症和应激反应、代谢和能量消耗、昼夜节律等方面都起重要的调节作用。它们主要存在于细胞核内，少量存在于细胞质内，是催化PAR(聚腺苷二磷酸核糖)合成的酶，PARP-1是一种聚ADP核糖聚合酶，其在正常细胞和肿瘤细胞中表达水平的差异、以及该差异在临床药物或PARP-1抑制剂共存时的变化对研究肿瘤的发生发展和疗效评价有重要意义。在此基础上，运用抑制剂抑制PARP参与介导的肿瘤细胞DNA损伤修复，更是当前研究热点之一。

PARP活性检测的传统技术主要有酶联免疫法，使用抗-PAR的单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠lgG二抗，建立检测沉积在免疫组蛋白上的PAR的比色方法或化学发光方法；或者采用放射性NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的方法来测定了PARP的酶活性。但此类方法有的需要标记，具有成本高、需要样品量较大、灵敏性差、检测时间长的缺点，而且有时候会得到假阳性结果。目前，Hergenrother等采用化学定量NAD⁺的方法间接测定了PARP-1的酶活性，可用于小分子抑制剂的高通量筛查；并合成了ADP-ribose-pNP 显色底物，发展了简单、灵敏的比色方法来评价PARP的活性。然而，这种方法需要繁琐的合成。因此，该方法存在很多局限性。

近年来，为解决PARP分析方法的弊端，研究者们已经开发了许多简单、可执行的分析方法并将之应用到PARP活性的检测中，例如比色检测、荧光检测、电化学检测等。例如，湖南大学聂舟教授利用PAR对荧光蛋白scGFP与阳离子聚合物CCP间荧光共振能量转移效率的调节作用，建立了PARP活性的荧光检测方法；南京师范大学戴志晖教授利用六氨合钌做指示剂，根据PAR静电吸附六氨合钌的量建立了PARP的电化学检测新方法；受以上方法的启发，我们建立了一种基于TOTO-1(噻唑橙二聚体-1)荧光检测PARP-1活性的方法，此方法无需标记，易操作，而且与上述的比色方法相比，具有稳定性高、检测线低、检测范围广的优点。

发明内容

发明目的：针对现有技术的问题，提供了一种基于荧光染料TOTO-1分析检测PARP-1 活性的方法。本发明中利用PARP-1催化合成的聚ADP核糖链与TOTO-1孵育后会有荧光信号增强作用，它具有灵敏度高、准确性好、无标记等优点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于TOTO-1分析检测PARP-1活性的方法，所述包括以下步骤：

(1)激活DNA、PARP-1、NAD+混合反应，PARP催化合成带大量负电荷的PAR 聚合物(聚ADP-核糖)；

(2)得到的产物用ExoⅢ切除双链，释放出所述PAR。

(3)将TOTO-1与产物PAR孵育1h，利用荧光光谱仪对产物溶液进行检测。