[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法

说明书

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，该方法包括病毒离心初步纯化、PEG6000沉淀法二级纯化、和透析袋透析纯化等步骤。该方法对PEG6000的浓度，沉淀时间，离心力进行优化，最大限度地提高病毒的回收率，以该方法纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒可以满足基本的实验室研究以及疫苗制备需求，相较于现有技术，以本发明制备的产品具有病毒滴度高，完整性好，背景清晰的优点，加之工艺简便，成本较低，因此有很好的推广前景。

技术领域

本发明涉及一种病毒纯化方法，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征又称为猪蓝耳病，是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病，引起猪严重繁殖障碍和呼吸道疾病。该病毒属于动脉炎病毒科属，是一种不分节段的单股正链RNA病毒，1987年该病首次在美国爆发，目前基本已经遍布所有养猪的国家，对全球的养猪业造成巨大的损失。2006年，我国发生了以高热，高死亡率为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征，世界动物卫生组织已将猪繁殖与呼吸综合征列为必须及时通报的动物疫病之一。目前商品化的蓝耳病毒疫苗主要是由经典株制备的弱毒活疫苗和由变异株制备的灭活苗，此类疫苗的安全性与免疫性受到许多因素的干扰，如病毒活性，病毒滴度，灭活工艺等等。商品化的疫苗如果用细胞培养繁殖的病毒直接制备，极其容易受到细胞碎片，培养基成分以及一些杂质的影响，导致疫苗免疫原性失常，接种后的动物发生过敏反应等情况，所以，提高病毒滴度和抗原纯净度是制备疫苗的必须途径。

目前，现有的蓝耳病毒纯化技术主要包括：(1)Sepharose 4FF凝胶层析纯化，该方法的优点是选用Sepharose 4FF凝胶作为层析介质，其病毒回收率与杂蛋白去除率高，纯化后的病毒免疫原性较好，但方法操作繁琐，成本较为高昂。(2)超速离心法沉淀法，该方法的优点是操作简便，但对仪器要求很高，并且超速离心会影响病毒的完整性，以该方法纯化后的病毒液纯净度也比较差。(3)蔗糖密度梯度离心法，该方法的优点是成本低，在一般实验内较为常用，但高浓度蔗糖的黏稠性和渗透性回对病毒颗粒造成损伤，所以不适用于疫苗的制备.

PEG全称为聚乙二醇，其结构稳定，不易变质，亲水性强，是研究中无免疫原性的理想材料之一，使用PEG沉淀病毒的优点有(1)沉淀效能高，使用极少的PEG就能即可沉淀相当多的生物大分子(2)操作条件温和，不易引起生物大分子的变性(3)沉淀后的有机聚合物容易去除

透析是生物化学实验室最简便常用的分离纯化技术之一，透析袋所用材料是纤维素所制成的半透膜，样品中的生物大分子被截留在袋内，一些盐与小分子物质则通过透析袋内外的浓度梯度，扩散透析至袋外，该方法简便高效，成本较低。

目前，在现有病毒纯化技术中，大多数实验室采用超速离心法以及密度梯度离心法，这两种方法因为过大的离心力和梯度溶液的高渗透性都极易损伤病毒的活性及完整性，近年来，层析技术快速发展，利用凝胶层析柱除去杂质的病毒纯化方法能够有效地避免病毒囊膜结构破坏，但该方法成本较高，步骤繁琐，而本发明所使用的PEG沉淀和透析纯化法都有被报道过可以用于纯化病毒，但鲜有实验室结合使用，只在血液蛋白纯化领域有过相关报道，PEG作为一种水溶性非离子型聚合物，亲水性强，有报道用其纯化鸡流感病毒时，可以大大提高病毒回收率并且保留病毒的完整性及活性，而结合上透析法，又可以去除病毒液中残留的PEG和一些细胞代谢产物，使病毒液的背景更为纯净。在PRRSV纯化方法领域，PEG沉淀和透析纯化法尚无报道。

发明内容

本发明旨在利用PEG沉淀和透析纯化结合的方式提供一种高效简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化法，已解决现有该病毒纯化法操作繁琐，成本较高，纯化效果不佳的问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法，该方法通过PEG沉淀法和透析袋纯化法来实现，过程如下：