[发明专利]一种透明质酸酶的制备方法在审
申请号: | 201810085468.3 | 申请日: | 2018-01-29 |
公开(公告)号: | CN108220272A | 公开(公告)日: | 2018-06-29 |
发明(设计)人: | 史政豪;徐国华;袁峰;赵伏梅 | 申请(专利权)人: | 江苏神华药业有限公司 |
主分类号: | C12N9/26 | 分类号: | C12N9/26;C12R1/84 |
代理公司: | 北京思创大成知识产权代理有限公司 11614 | 代理人: | 尹慧晶 |
地址: | 211600 江苏*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 透明质酸酶 制备 发酵工程技术 优化发酵条件 高效表达 甘油 补加 甲醇 水蛭 生产成本 诱导 应用 | ||
1.一种透明质酸酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将透明质酸酶的生产菌种接入种子培养基中并培养至对数期;
(2)将步骤1)得到的种子液按10~15%的接种量接入发酵培养基,通入氧气,控制溶氧20~50%、pH为5.3~5.5,在温度为29.5~30.5℃的条件下进行发酵,细胞产量达到50~100g/L湿细胞;
(3)发酵结束后,开始流加浓度50%的甘油溶液,并在甘油溶液中添加PTM1,PTM1的添加量为10-15mL/L甘油;补料速度为16~20mL每小时每升初始发酵液体积,补料时间为10~14h,本阶段完成后细胞产量达到180~220g/L湿细胞;
(4)进入甲醇诱导阶段,终止甘油的补料并且开始用含10-15mL/L PTM1的甲醇进行诱导,设定补料速率为3.0~4.0mL/h每升初始发酵液体积,此补料速率维持1~3h;然后补加速率增加至7.0~8.0mL/h每升初始发酵液体积,维持2~4h;最后,增大甲醇流加速率至10~12mL/h每升初始发酵液体积,并保持至发酵过程结束。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述透明质酸酶的生产菌种为重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述种子培养基包括酵母抽提物9~11g/L,蛋白胨19~21g/L,葡萄糖19~21g/L。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述种子培养基包括酵母抽提物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述发酵培养基为甘油35~45g/L,K2SO4 18~19g/L,MgSO4·7H2O 14~15g/L,KOH 4~5g/L,85%H3PO4 26~27mL/L,CaSO4·2H2O 0.5~1.0g/L,PTM1微量元素4.35mL/L。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述发酵培养基包括甘油40g/L,K2SO418.2g/L,MgSO4·7H2O 14.9g/L,KOH 4.13g/L,85%H3PO4 26.7mL/L,CaSO4·2H2O 0.93g/L,PTM1微量元素4.35mL/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的接种量为15%,溶氧控制在20~40%,pH为5.3~5.5、温度30℃,发酵24h,这个阶段所达到的细胞产量为70~80g/L湿细胞。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)甘油补料速率为18.15mL每小时每升初始发酵液体积,并维持12个小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)设定最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积,此补料速率维持2h;然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积,此补料速率维持3h;最后,增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积。
10.根据权利要求1~9任一项所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)挑取透明质酸酶生产菌单菌落于种子培养基中,在30℃、pH为6~8、200~220rpm的条件下培养24h;
(2)将步骤(1)得到的产物按15%接种量接入发酵培养基,通入氧气,控制溶氧20~40%、pH为5.3~5.5,在温度为29.5~30.5℃的条件下进行发酵,待甘油消耗殆尽,细胞产量达到70~80g/L湿细胞;
(3)发酵结束后,开始流加甘油溶液,并在甘油溶液中添加PTM1,PTM1的添加量为12mL/L甘油溶液;甘油补料速率为18.15mL每小时每升初始发酵液体积,并维持12个小时;本阶段完成后细胞产量达到180~220g/L湿细胞;
(4)进入甲醇诱导阶段,终止甘油溶液的补料,流加含有12mL/L PTM1的纯甲醇进行诱导,甲醇在发酵液中的含量为1.8%;设定最初的甲醇补料速率3.6mL/h每升初始发酵液体积,此补料速率维持2h;然后补料速率增加至7.3mL/h每升初始发酵液体积,此补料速率维持3h;最后,增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始发酵液体积至诱导结束。
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