[发明专利]用于糖蛋白检测的硼酸盐及制备该硼酸盐的方法

说明书

本发明公开了一种用于糖蛋白检测的硼酸盐，具体为6‑羧基‑4',5'‑二氯‑2',7'‑二甲氧基异硫氰酸荧光素苯硼酸盐，其制备方法包括如下步骤：将2‑氯‑4‑甲氧基‑1,3‑苯二酚和4‑硝基苯二甲酸酐反应制得4,5‑二氯‑2,7‑二甲氧基‑6‑异硫氰基‑荧光素，然后将所述4,5‑二氯‑2,7‑二甲氧基‑6‑异硫氰基‑荧光素与间氨基苯硼酸反应制得6‑羧基‑4',5'‑二氯‑2',7'‑二甲氧基异硫氰酸荧光素苯硼酸盐。本发明硼酸盐能特异性结合糖化蛋白，具有结构稳定，灵敏度高等优点，可应用于人体糖蛋白的检测。

技术领域

本发明涉及糖蛋白检测领域，具体涉及一种用于糖蛋白检测的硼酸盐及制备该硼酸盐的方法。

背景技术

糖蛋白是含糖的蛋白质，由寡糖链与肽链中的一定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成。其主要生物学功能为细胞或分子的生物识别，如卵子受精时精子需识别卵子细胞膜上相应的糖蛋白。受体蛋白、肿瘤细胞表面抗原等亦均属糖蛋白。糖蛋白普遍存在于动物、植物及微生物中，种类繁多，功能广泛。可按存在方式分为三类:1、可溶性糖蛋白，存在于细胞内液、各种体液及腔道腺体分泌的粘液中。血浆蛋白除白蛋白外皆为糖蛋白。可溶性糖蛋白包括酶(如核酸酶类、蛋白酶类、糖苷酶类)、肽类激素(如绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促甲状腺素、促红细胞生成素)、抗体、补体、以及某些生长因子、干扰素、抑素、凝集素及毒素等。2、膜结合糖蛋白，其肽链由疏水肽段及亲水肽段组成。疏水肽段可为一至数个，并通过疏水相互作用嵌入膜脂双层中。亲水肽段暴露于膜外。糖链连接在亲水肽段并有严格的方向性。在质膜表面糖链一律朝外；在细胞内膜一般朝腔面。膜结合糖蛋白包括酶、受体、凝集素及运载蛋白等。此类糖蛋白常参与细胞识别，并可作为特定细胞或细胞在特定阶段的表面标志或表面抗原。3、结构糖蛋白，为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白，如胶原及各种非胶原糖蛋白(纤粘连蛋白、层粘连蛋白等)。它们的功能不仅仅是作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，更重要的是参与细胞的识别、粘着及迁移，并调控细胞的增殖及分化。

寡糖链通常指由2-10个单糖基借糖苷键连成的聚合体。糖蛋白的寡糖链多有分枝。由于单糖的端基碳(异头碳)原子有α、β两种构型，而且单糖分子中存在多个可形成糖苷键的羟基，因此，糖链结构的多样性超过多核苷酸及肽链。在糖链结构中可以贮存足够的识别信息，从而在分子识别及细胞识别中起决定性作用。糖蛋白参与的生理功能包括凝血、免疫、分泌、内吞、物质转运、信息传递、神经传导、生长及分化的调节、细胞迁移、细胞归巢、创伤修复及再生等。糖蛋白的糖链还参与维持其肽链处于有生物活性的天然构象及稳定肽链结构，并赋予整个糖蛋白分子以特定的理化性质(如润滑性、粘弹性、抗热失活、抗蛋白酶水解及抗冻性等)。

糖蛋白与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展有关。再者，细胞表面的糖蛋白及糖脂可脱落到周围环境或进入血循环，它们可以作为异常的标志为临床诊断提供信息；患某些疾病时体液中的糖蛋白亦常有特异性或强或弱的改变,这可有助于诊断或预后的判断。

欧洲专利EP0772779B1公开了一种糖蛋白检测方法，其利用硼酸盐与糖蛋白的特异性结合这一基本特征，设计带有特定吸收和激发荧光基团的硼酸盐化合物，并具体公开了采用通式为F-A-B(OH)₂的化合物作为上述检测试剂。其中F是荧光素，A是-NH-CS-NH-Ph-基团，用以连接荧光素和硼酸基团，其化学结构式如下：

特异性结合糖蛋白的是化合物上的硼酸基团。在特定波长的激发下，该硼酸盐化合物中的荧光基团被激发产生荧光信号。当该硼酸盐化合物结合糖蛋白后，在特定波长激发下，其产生的荧光因能量传导被淬灭而不再产生荧光。这种淬灭效应随着体系中糖蛋白含量的升高而增强。利用此原理，可设计检测体系，通过监测荧光强度的变化，定量检测人体糖蛋白的含量。然而，该硼酸盐化合物存在如下问题：1、其激发光和吸收光波长较短，容易相互干扰，影响检测精度。2、该硼酸盐的荧光强度较弱，检测灵敏度和准确度有待进一步提高。

发明内容