[发明专利]一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法

说明书

本发明涉及一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。本发明首次将NOD遗传背景小鼠中的ApoE和LDLR基因进行同时敲除，获得了NOD遗传背景小鼠的能产生动脉粥样硬化的基因敲除小鼠模型。本发明获得NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的主动脉有明显的动脉粥样硬化斑块形成，与传统经典的动脉粥样硬化模型C57B/L6背景ApoE基因敲除小鼠相比，其发病程度一致，本发明的方法为研究者提供一种全新的NOD遗传背景动脉粥样硬化的基因敲除小鼠模型，对动脉粥样硬化的基础理论研究和临床诊断治疗具有十分重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。

背景技术

动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的主要原因之一，对其机理进行深入研究将有助于解决心脑血管疾病治愈困难、死亡率高的难题。NOD小鼠为非肥胖糖尿病品系，30周龄时糖尿病累计发病率雌雄分别为60～80％和20～30％，雌鼠有胰岛素依赖性糖尿病，临床症状与人类I型糖尿病相当类似，NOD小鼠是I型糖尿病研究和人源化模型建立中使用最为广泛的小鼠品系，但NOD遗传背景小鼠基因敲除模型仍极其缺乏，特别是在动脉粥样硬化研究领域。

已经有研究结果表明，NOD遗传背景小鼠对动脉粥样硬化疾病具有很强的抗性(Keren P,George J,Keren G,Harats D:Non-obese diabetic(NOD)mice exhibit anincreased cellular immune response to glycated-LDL but are resistant to highfat diet induced atherosclerosis.Atherosclerosis 2001,157:285-292.)，而且本实验室已有前期结果表明，即使在NOD遗传背景小鼠中单独敲除ApoE或者是LDLR基因以后，经过高脂饲料喂养，也均不能诱导单基因敲除小鼠发生动脉粥样硬化疾病，所以在NOD遗传背景小鼠中获得能产生动脉粥样硬化的基因敲除模型，将具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法，该方法可操作性强，构建成功率高，为研究动脉粥样硬化和I型糖尿病及其并发症提供了很好的小鼠遗传模型。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种NOD遗传背景的动脉粥样硬化小鼠模型的制备方法，包括：将NOD小鼠中ApoE基因和LDLR基因共同敲除后，即得。

由于NOD遗传背景小鼠对动脉粥样硬化疾病具有很强的抗性，本发明为了在NOD遗传背景小鼠中获得能产生动脉粥样硬化的基因敲除小鼠模型，首次将NOD遗传背景小鼠中的ApoE和LDLR基因进行同时敲除。通过进一步的实验研究，结果表明ApoE和LDLR双基因缺失的小鼠，在经过高脂饲料喂养诱导后，小鼠的主动脉有明显的动脉粥样硬化斑块形成，与传统经典的动脉粥样硬化模型C57B/L6背景ApoE基因敲除小鼠相比，其发病程度一致，表明NOD遗传背景动脉粥样硬化的基因敲除小鼠模型构建成功。本发明首次在NOD小鼠中实现ApoE和LDLR双基因敲除，并获得可以实现高脂诱导动脉粥样硬化症的稳定遗传模型。

在敲除所述ApoE基因时采用CRISPR/Cas9系统，选择3个靶序列，分别如下所示：

ApoE-sgRNA1：5‘-CCTAGCCGAGGGAGAGCCGG AGG-3’；

ApoE-sgRNA2：5‘-GTAATCCCAGAAGCGGTTCA GGG-3’；

ApoE-sgRNA3：5‘-CTTCTGGGATTACCTGCGCT GGG-3’。

在敲除所述LDLR基因时采用CRISPR/Cas9系统，选择3个靶序列，分别如下所示：