[发明专利]引物组及试剂盒

说明书

本发明提出了一组引物组以及包含该引物组的试剂盒。利用根据本发明实施例的引物组是针对Y染色体的6个STS位点设计的引物组，该引物组可应用于单个多重聚合酶链式反应，即在同一个PCR反应中使用该组引物进行扩增，可同时得到多个PCR反应产物。相比于常规的PCR，其操作更为简便，也缩短了实验的耗时，成功实现了6个STS在一个多重PCR反应中进行扩增。根据本发明实施例的试剂盒用于检测Y染色体微缺失，相比于现有技术，具有灵敏度更高、操作更简便、结果更易于解读、对标本要求更低的优势。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及引物组及试剂盒。

背景技术

Y染色体长臂q11.23区域上存在着与精子发生相关的基因，称为无精子因子(azoospermia factor，AZF)。AZF分为AZFa、AZFb、AZFc 3个区域，任何一个区域的微缺失都会导致精子生成障碍，引起少弱精子症或无精子症。目前研究表明，在AZF区存在大量的回文结构和重复序列，使这一区域非常容易发生结构上的异常，如缺失、倒位及序列重排等。引发所在区域相关基因的突变，导致男性不育的发生。由于所在区域存在基因的不同，决定不同区域缺失引起的男性不育表型的差异。研究表明，发生AZFa区的缺失可能导致男性原发性无精，即使进行睾丸活检也难以获得精子；AZFb区的缺失可能导致男性无精或重度少精，但一部分患者仍可通过睾丸活检获得精子；AZFc区发生缺失，表型较为复杂，主要表现为少精或弱精。还有研究表明，AZF区域缺失是可以发生世代传递的，并在传递的程中缺失区域有进一步扩大的风险。因此，常规开展AZF区域的缺失检测具有很强的临床指导及遗传咨询的意义。

序列标签位点(sequence-tagged site，STS)，是已知核苷酸序列的单拷贝的DNA片段。位于Y染色体AZF区域的STS位点可用于判断样本是否存在Y染色体微缺失。在欧洲2013版操作指南(《EAA EMQN best practic gudelines for moleccular diagnosis of Ychromosomal microdeletions state of the art 2013》)详述了与AZF微缺失相关的STS位点，其中用于判别缺失的核心位点包括AZF a区的sY84、sY86，AZF b区的sY127、sY134，AZF c区的sY254、sY255。通常地，一个区域的缺失会造成相应STS位点无法检出，在PCR扩增验证时呈无扩增产物，借以判断样本Y染色体微缺失情况。

复合扩增(Mutiplex PCR)相对单对引物扩增而言，可以在单个PCR反应中运用多对引物同时扩增多个产物，极大地提高检测效率。这种方法不仅能高效检测特定产物，而且节约经济成本与时间成本，降低操作的冗繁性。但多重扩增也存在一些需要解决的问题，如非特异性产物的生成、引物之间相互拮抗而造成扩增效率下降等问题。一个优良的多重PCR产物，应当是目的条带清晰且各条带间可清晰区分，同时不存在副产物，不出现假性结果。为了解决这些问题，通常需要不断调试引物的配比。

目前，对于Y染色体微缺失的检测有以下几种方法。一是基于多重PCR的电泳检测法。而具体的电泳介质又可分为琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。由于每个STS位点都有其固定的长度，通过高浓度琼脂糖凝胶或是聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后，使用相应的染料进行染色。在DNA分子量标准的对照下可直接准确区分不同长度的STS位点。这种方法的优势是价格低廉且没有大型仪器的依赖性，能够大面积推广，但存在了如检测灵敏度低等缺陷。各别STS条带一旦未检出则需要重新以单引物形式验证，若是要获得清晰的电泳结果需要依赖于娴熟的分子试验操作。且由于备选的6个位点个别片段大小接近，所以若设置单个PCR需要重新设计或是设置若干个多重PCR体系以满足需求。

二是二代测序的方法。通过对每个位点设置大量的引物，通过构建文库等步骤以二代测序的手段进行检测。该方法的优势在于能获得足够全面的Y染色体微缺失结论，而缺陷在于成本过高、操作繁琐，且对技术人员的要求较高，其结果不易于快速解读。