[发明专利]一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明将来源于微生物Dorea sp.的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为亲本，构建了突变体酶F154Y/E191D/I193F，该突变体的热稳定性和结构稳定性得到了提高：50℃和60℃的t_1/2值分别达到20.47和3.09h；T_m值达到74.18℃。多点突变体的最适温度上升为75℃，与野生型酶相比提高了5℃。在最适催化条件下，酶催化底物D‑果糖生成D‑阿洛酮糖的相对酶活提高了3.8％，这一发现对于工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的研究价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-Allulose)是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量甜味剂。D-阿洛酮糖属于己酮糖，是一种六碳糖，是D-果糖的C-3差向异构体。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品。此外，因其独特的生理功能，D-阿洛酮糖在临床医学中具有潜在较大的应用价值，例如治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病。此外，D-阿洛酮糖还可以通过添加辅料进行喷雾干燥，这将有助于肺部药物给送。除此外，有文献报道D-阿洛酮糖还是合成其他稀有糖的重要材料，在D-阿卓糖、D-阿洛糖和D-塔洛糖醇的生物生产中起着至关重要的作用。然而，D-阿洛酮糖在自然界中存在量极其稀少，而且化学法合成困难，所以D-阿洛酮糖的生物合成法成为了研究的热点。

根据Izumoring稀有糖转化策略，酮糖3-差向异构酶在D-阿洛酮糖生物转化中起着不可替代的作用——催化D-果糖和D-阿洛酮糖在C-3位置发生可逆的差向异构化反应。目前，对于酮糖3-差向异构酶的研究已经较为广泛，包括微生物筛选鉴定、酶的分离纯化、异源重组表达、酶固定化、食品级表达、分子改造和晶体结构解析。

发明内容

本发明的目的是根据已有酮糖3-差向异构酶的晶体结构进行同源建模，分析关键位点氨基酸残基，使用定点突变的方法对Dorea sp.DPEase的进行催化效率和热稳定性改造。选择亚基间内表面的非保守氨基酸残基进行突变，寻找热稳定性提高的突变体，提供一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶F154Y/E191D/I193F，对D-阿洛酮糖的合成具有重要的现实意义。

本发明提供的热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶F154Y/E191D/I193F，是将来源于微生物Dorea sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行突变得到单突变体酶；具体说，是将原来Dorea sp.DPEase酶中的Phe154位的苯丙氨酸突变为络氨酸Tyr，Glu191位的谷氨酸突变为天冬氨酸Asp，Ile193位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸Phe，获得多点突变体酶，命名为F154Y/E191D/I193F。

与野生酶Dorea sp.DPEase相比，所述Dorea sp.DPEase的突变体酶F154Y/E191D/I193F的最适pH均没有发生改变，最适温度升高了5℃；相对酶活、动力学参数也没有发生明显变化。热稳定性和结构稳定性得到了提高：50℃和60℃的t_1/2值分别达到20.47和3.09h；T_m值达到74.18℃。在原始酶的最适催化条件下，酶催化底物D-果糖生成D-阿洛酮糖的相对酶活提高了3.8％，这一发现对于工业化制备D-阿洛酮糖具有重要的研究价值。

本发明还提供一种携带编码所述突变体酶F154Y/E191D/I193F的基因的重组表达质粒pET-22b(+)-F154Y/E191D/I193F。

本发明还提供一种表达所述突变体酶F154Y/E191D/I193F的重组大肠杆菌BL21(DE3)，其含有携带编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶F154Y/E191D/I193F的基因的重组质粒pET-22b(+)-F154Y/E191D/I193F。