[发明专利]一种基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法

说明书

本发明提供了一种基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法，包括以下步骤：(1)将待鉴定信号肽与大豆疫霉XEG1的C端融合，构建表达载体，所述大豆疫霉XEG1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；(3)将步骤(2)的感受态细胞注射入植物细胞中，观察注射位点植物细胞坏死情况，若注射位点植物细胞坏死，则待检测信号肽具有分泌功能，若注射位点植物细胞无坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能。

技术领域

本发明属于分泌蛋白信号肽快速检测技术领域，具体地说，涉及一种利用XEG1在细胞外引起坏死的特点，在植物细胞上快速验证分泌蛋白信号肽的方法。

背景技术

分泌蛋白指在细胞内合成，分泌到细胞外起作用的蛋白质。信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由15-30个氨基酸组成，在信号肽的引导下，新合成的蛋白质被分泌到胞外发挥作用。植物病原菌大豆疫霉的病原相关分子模式蛋白XEG1在有信号肽的情况下可以在烟草上引起细胞坏死，去除信号肽则不能引起坏死。因此将需要检测的信号肽部分和XEG1无信号肽的C端融合，在细胞中表达，如果待检测信号肽有功能，则能引导XEG1至细胞外，引起细胞坏死；如果待检测信号肽没有功能，则不能引导XEG1至细胞外引起坏死。

当前，检测分泌信号肽功能的方法还有酵母的pSUC2系统，或者在病原菌中对分泌蛋白融合标签蛋白进行超量表达，并进行检测等。酵母系统需要进行酵母转化，并且在多种培养基上验证，操作过程繁琐，费用高。在病原菌中超量表达融合有标签蛋白的分泌蛋白，需要进行病原菌的转化，效率较低，周期长，并且费用较高。现有技术亟需一种操作简单、成本低、准确率高、效率高且耗时短的检测具有分泌功能信号肽的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、准确率高、成本低、耗时短的鉴定信号肽是否具有分泌功能的方法。本发明利用分泌蛋白XEG1在植物细胞外引起细胞死亡的特点，将待检测信号肽和XEG1去信号肽部分融合，在植物细胞中表达并观察是否引起坏死，可以快速高效的检测信号肽是否具有分泌功能。

本发明提供了一种基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法，包括以下步骤：

(1)将待鉴定信号肽与病原相关分子模式蛋白无信号肽的C端融合，构建表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；

(3)将步骤(2)的感受态细胞注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点细胞坏死，则待检测信号肽具有分泌功能，若注射位点细胞无坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能。

所述病原相关分子模式蛋白为大豆疫霉XEG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤(1)所述表达载体为植物瞬时表达载体。

步骤(2)所述感受态细胞为农杆菌感受态。

步骤(3)所述植物为烟草、马铃薯、番茄、辣椒。

本发明提供的基于病原相关分子模式蛋白鉴定具有分泌功能信号肽的方法还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤(1)阶段，将大豆疫霉无毒效应蛋白Avr1b的信号肽连接病原相关分子模式蛋白无信号肽的C端构建表达载体得到。

优选地，阳性对照为将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述的Avr1b的信号肽连接氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示大豆疫霉XEG1的无信号肽的C端构建植物瞬时表达载体得到。

本发明提供了上述方法在筛选具有分泌功能信号肽中的应用。

进一步地，通过本发明的方法可以筛选得到具有分泌功能的信号肽，本领域技术人员可以利用这些信号肽应用于异源基因表达。

基于此，本发明提供了上述方法在制备转基因植物中的应用。