[发明专利]一种RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系及其构建方法

说明书

本发明提供一个应用于一种RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系及其构建方法，该方法是通过两个分别包含抗生素筛选基因的同源重组载体、gRNA载体TRDMT1‑gRNA，以及表达Cas9的载体混合转染HEK293细胞，将两个抗生素筛选基因和转录终止信号片段整合到TRDMT1基因的第一外显子前，以终止其转录，通过抗性筛选，获得RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系。通过本发明所获得细胞系，性状稳定，为进一步为研究TRDMT1基因功能提供可靠的细胞模型，也为RNA甲基化功能研究提供一种有效的方法。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一个利用CRISPR/Cas9系统构建RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系的方法。

背景技术

哺乳动物中TRDMT1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1)是RNA介导的表观遗传的一个必须成分。TRDMT1之前被认为是DNA甲基转移酶，最近的研究表明其功能主要为RNA甲基转移酶。RNA甲基化作为普遍的表观遗传标记，在基因调控中发挥关键作用的。至今为止，已经发现RNA存在100多种修饰，其中甲基化是主要的修饰形式，6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)是其中最具有代表性的两种修饰。有研究指出，这种修饰可以稳定tRNA的二级结构，影响氨酰化的形成及密码子的识别。此外，m5C修饰还存在于rRNA结合tRNA发挥翻译活性的区域。由于检测技术的限制，真核生物mRNA一开始被认为是缺乏m5C修饰的，直到第一次全转录组m5C定位发现，m5C在人类mRNA和ncRNA中是一种重要的修饰。近年来越来越多的证据表明，m5C修饰对mRNA结构的稳定及功能的调节起重要的作用。

CRISPR/Cas9系统是第三代人工核酸内切酶，与第一代锌指核酸内切酶(ZFNs)以及第二代类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)相比，更简便，成本低，更容易在实验室使用。CRISP/Cas9系统原理是成熟的crRNA和traRNA结合，形成gRNA。gRNA定位到靶序列，介导Cas9蛋白识别PAM序列，在目的片段进行切割，形成DNA双链(Double-strand break，DBS)缺口，启动基因组自我修复功能，进行非同源末端链接以及同源重组，来实现对基因组基因定点敲除、特异性突变以及定点修饰。本研究所用HEK293细胞系，即人胚肾细胞系，是293细胞的一种衍生株，来源于人胚肾，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。该细胞系极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达外源基因的细胞株。本发明利用CRISPR/Cas9系统的精确靶向性,构建RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系，为RNA甲基化研究提供一种有效的工具。

发明内容

本发明目的是提供一种RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系及其构建方法。其主要原理是：利用CRISPR/Cas9技术在基因组通过gRNA定点结合，Cas9蛋白精确切割形成双链缺口，通过同源和非同源重组，来实现移码突变，从而达到基因组层面敲除。而在细胞中通过同源重组的方式定向敲入转录终止信号，终止基因的表达，达到敲除的效果。同时通过抗性基因进行快速筛选，从而建立稳定敲除的细胞系。所获得细胞系，性状稳定，为进一步为研究TRDMT1基因功能提供可靠的细胞模型，也为RNA甲基化功能研究提供一种有效的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系的构建方法,通过两个分别包含抗生素筛选基因的同源重组载体、gRNA载体TRDMT1-gRNA，以及表达Cas9的载体混合转染HEK293细胞，将两个抗生素筛选基因和转录终止信号片段整合到TRDMT1基因的第一外显子前，以终止其转录，通过抗性筛选，获得RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系。