[发明专利]一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法

权利要求书

1.一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)、检测筛选剂对水稻愈伤组织生长的影响；

步骤(2)、抗性基因-筛选剂组合的筛选。

2.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的筛选剂包括壮观霉素、潮霉素B、草丁膦、草甘膦中的至少两种。

3.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)的检测方法为：将愈伤组织放置在的筛选培养基上，培养后称量愈伤组织的重量，计算不同种类和浓度的筛选剂对愈伤组织重量增长的影响。

4.根据权利要求3所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，筛选培养基为按照水稻继代培养基配方同水稻幼穗愈伤组织诱导培养基配方添加不同种类、不同浓度的筛选剂配制而成。

5.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)的筛选方法为：

(5.1)、提取携带不同抗性基因的载体，根据载体中已知的pCAMBIA1301中的HPT基因、pCAMBIA3301中的bar基因和pCAMBIA330E中的EPSPS基因设计引物，引物两端分别添加PvuII酶切位点，通过PCR扩增获得该三个基因的片段；

(5.2)、三个抗性基因的PCR产物回收后连接到原核表达载体pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间，将抗性基因正确插入到原核表达载体pEASY-synth的Prrn启动子与Trps16终止子之间的阳性克隆命名为pSYNTH-HPT、pSYNTH-bar、pSYNTH-soilA；

(5.3)、将含有载体pSYTH-HPT、pSYTH-bar、pSYTH-soilA的大肠杆菌Mach1菌液分别接种于含有与其相对应的筛选剂的M9液体培养基和添加L-脯氨酸的液体培养基上，并将含有载体pEASY-synth的大肠杆菌Mach1细胞作为对照，分析其OD值的变化；

(5.4)、选择能够耐受10倍浓度以上筛选剂用量且筛选效果不受培养基成分中L-脯氨酸影响的抗性基因和筛选剂的组合。

6.根据权利要求1所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立。

7.根据权利要求6所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述适合叶绿体转化的水稻基因型筛选与高频再生体系建立方法包括：水稻幼穗愈伤组织的诱导；愈伤组织的分化；分析多轮继代培养对其分化的影响；再生植株生根与移栽。

8.根据权利要求7所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述水稻幼穗愈伤组织的诱导方法为：在水稻进入孕穗期后，将水稻茎秆拔出，灭菌，取出幼穗，接种于愈伤组织诱导培养基上，观察愈伤诱导情况，计算诱导率，鉴别愈伤组织的类型。

9.根据权利要求7所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，所述愈伤组织的分化方法为：取II型水稻愈伤组织，分别置于分化培养基上进行分化培养，计算分化率和高频分化率。

10.根据权利要求7所述的一种水稻叶绿体遗传转化过程中筛选条件的构建方法，其特征在于，分析多轮继代培养对其分化的影响方法为：将筛选出的多个品系的愈伤组织，放置在水稻诱导培养基上，每隔20天左右继代一次，连续继代10次，然后分别置于最适的分化培养基上分化培养40天，照相记录，分析多轮继代培养对其分化的影响，统计分化率和高频分化率。