[发明专利]利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用转染了R6的MEF制备新型饲养层细胞的方法，首先利用结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物样Tale的抑制性转录因子R6转染MEF获得永生型MEF细胞系R6‑MEF，经过对多种R6‑MEF细胞系筛选后，选择多能性基因表达较高的R6‑MEF细胞系，经丝裂霉素处理后获得新型饲养层细胞R6‑feeder，获得的饲养层细胞能够很好的维持胚胎干细胞ESC和诱导性多能干细胞的多能性iPSC。该方法不仅为干细胞的培养和研究提供了新的选择，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。

技术领域

本发明属于适用于多能干细胞培养的新型饲养层细胞的制备方法，特别涉及一种利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)是指从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞中，经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，无论在体内或者体外环境，均能被诱导分化为机体所有类型成体细胞。诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell,iPSC)是通过导入特定的转录因子使成体细胞直接重编程为胚胎干细胞(ESC)样的多能性干细胞。iPSC同样具有自我更新和分化的全能性，其功能与胚胎干细胞类似，无需制造胚胎，从任何组织的细胞都可以制造出具有干细胞功能的细胞,避免了转基因面临的伦理问题，更重要的是简化了制备转基因动物的过程。源自患者的诱导多能干细胞，进一步用于自体移植可避免免疫排斥问题。iPSC产生机理与相关技术的深入研究，将会给治疗人类疑难疾病、组织修复与再生以及生物制药等诸多生物医学领域带来新的发展机遇。而胚胎干细胞和诱导性多能干细胞在体外培养时容易出现分化，所以胚胎干细胞培养的关键是找到适合的培养条件，保持其未分化状态，而饲养层是维持胚胎干细胞未分化状态的一个关键因素，因此寻找一种新的适合干细胞生长的饲养层具有重要意义。

在目前的多能细胞培养体系中，无论是胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)，还是原始生殖细胞(PGC)，均须与饲养层细胞共培养。这是因为饲养层细胞能够合成分泌多种因子，如成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)及白血病抑制因子(LIF)等，在多能干细胞分离、培养过程中起促进增殖、抑制分化及维持多能性等重要作用。因此，探讨及优化饲养层细胞对完善多能性干细胞的培养体系具有重要意义。

饲养层是经有丝分裂阻断剂处理后的细胞单层，处理后的细胞失去增殖能力，但仍然具有产生多种生物活性物质能力，从而影响其它细胞的增殖和分化。饲养层细胞通常由小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryo Fibroblast,MEF)构成，多用于ESC和iPSC的体外培养和建系。据报道从MEF的条件培养液中可以分离到的蛋白多达136种因子，其中的白血病抑制因子(LIF)可使ESCC在未分化状态下长期培养，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和干细胞生长因子(SCF)对ESCC的生长起促进作用。目前，饲养层细胞通过γ照射或MMC有丝分裂灭活。γ射线可以同时处理比MMC更多的细胞，但钴-60的γ射线辐射源是稀有而昂贵的。MMC的可购性、灵活性和便利性使其成为制备饲养层细胞的良好常规方案。

较为常用的饲养层细胞有两类：有限系的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和无限系的STO细胞(SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain rESCistant，STO)。STO细胞系由加拿大多伦多安大略癌症研究所的A.Bernstein从SIM(Sandos Inbred Mice)小鼠胚胎成纤维细胞的连续谱获得。选择6-硫鸟嘌呤和乌本苷抗性的群体，对HAT培养液敏感并且是HPRT阴性的。STO细胞能在体外长期培养，使用方便，应用较广泛，但STO细胞在体外若经长期连续传代，常会产生胞质空泡、致密体生成等异常现象，导致细胞功能发生改变，影响饲养层质量。SNL即稳定转染了neo和LIF的STO细胞系，建系后稳定表达LIF，可以当作饲养层细胞培养ESC。