[发明专利]利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法

权利要求书

1.一种利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)细胞制备

获取胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs；获取R6-MEF细胞系；

所述获取胎鼠的成纤维细胞Oct4-GFP MEFs，包括以下步骤：将孕鼠体外获得的胎鼠洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.25％的Trypsin-EDTA消化液37℃水浴中消化20min，吹打混匀后加入M10培养液终止消化，1000rpm离心10min，弃掉上清，M10培养液重悬后转移至T25培养瓶中于37℃、5％CO₂培养箱中培养，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代或原代冻存备用；

所述获取R6-MEF细胞系，包括以下步骤：

A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：将Oct4-GFP MEFs使用M10培养液培养于6孔板中，待其达到40％汇合度时进行转染，转染12-18h；

B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养继续培养；脂质体转染后第三天更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞；脂质体转染后第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时进行传代培养，观察并及时更换M15+Dox培养液；当有生长速度较快并且形成明显克隆的细胞时，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存；

所述R6-MEF细胞系制备中，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7；

2)获得新型饲养层细胞R6-feeder

从获得的R6-MEF细胞系中挑选多能性基因表达较高的细胞系并增至150mm培养皿，待细胞汇合度达到80％时添加丝裂霉素C，最后收集细胞计数并冻存；所述丝裂霉素C的最佳处理浓度为5μg/mL，丝裂霉素C处理时间为2.5h。

2.根据权利要求1所述的利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：所述获得新型饲养层细胞R6-feeder，包括以下步骤：

A、解冻R6-MEF：将冻存在液氮罐中的R6-MEF取出快速解冻接种于6孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

B、R6-MEF的扩增：待细胞的汇合度达到80-90％后，按1:50的比例扩至150mm培养皿；

C、丝裂霉素C处理并收集冻存：待细胞汇合度达到80％时，添加丝裂霉素C，丝裂霉素C浓度为5μg/mL，处理时间为2.5h；丝裂霉素C处理完成后收集细胞计数并将细胞冻存。

3.根据权利要求1所述的利用转染Xist Tale抑制性转录因子R6的MEF制备饲养层细胞的方法，其特征在于：还包括对R6-feeder和STO-feeder培养的iPSCs进行多能性鉴定，包括以下步骤：

A、iPSCs总RNA提取：收集传代5次后的iPSCs进行总RNA提取，利用RNA提取试剂盒完成iPSCs的总RNA提取；

B、iPSCs cDNA的制备：使用反转录试剂盒制备iPSCs的cDNA；

C、进行qPCR：使用qPCR试剂盒进行qPCR，反应完成后保存数据并进行分析。