[发明专利]一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，属于细胞技术领域。本发明通过用慢病毒介导hTERT基因转染获得的细胞系，激活了树鼩肠上皮细胞的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的树鼩肠上皮细胞，所建立的永生化树鼩肠上皮细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化树鼩肠上皮细胞保持了与原代树鼩肠上皮细胞十分相近的表型，保持了细胞接触抑制和细胞增殖的密度限制，用呼肠孤病毒感染以后能够出现CPE，所以能够用于病毒感染等研究。

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，该细胞系保持着原代细胞的生物学特性。

背景技术

肠道是机体内最大的免疫系统之一，有着80％左右的免疫细胞。肠上皮在肠道内是一道天然的物理屏障，与诸多因素有着密切的联系，如与疾病的发生、与肠道免疫细胞的相互作用、与肠道内的免疫耐受以及与炎症的发生等。但受到原代肠上皮细胞的体外培养一般不超过15天的限制，影响了许多实验的进行及实验的重复性。建立永生化的树鼩小肠上皮细胞系，则可以在很多方面得到应用，包括各种病原感染的疾病模型、细胞信号通路的研究、肠道疾病药物机制的研究以及癌症研究等。

树鼩作为人类的近亲正在被实验动物标准化。研究发现成年发病树鼩肠道中呼肠孤病毒的携带率高达76％，正常乳树鼩呼肠孤病毒携带率为20％。乳树鼩感染呼肠孤病毒后能在脑、心、肝、脾、肺、肾组织中复制，并造成这些器官的损伤。所以建立永生化的肠上皮细胞，能够为病毒受体等相关研究提供很好的细胞模型，并可减少对树鼩的使用。

目前，仅2016年马娜等人有关于永生化树鼩肝细胞的报道，并且她们的方法是用SV40的T抗原基因转染树鼩原代肝细胞来建立的细胞系。这种方法能够成功的建立永生化细胞系，但是该细胞系的端粒会随着传代次数的增加而缩短。除了肝细胞，树鼩其他器官组织细胞的永生化未见报道。

永生化细胞系建立的传统的方法主要包括两类，一是用病毒与细胞共培养来建立永生化细胞系，如EBV、HPV等，二是用基因工程的方法将抑癌基因敲除(p53、pTEN)、致癌基因敲入(Myc、c-Jun、c-Ias、vsrc、Mdm2)来建系。

传统的方法存在对于树鼩原代肠上皮细胞系的建立效果不理想、建立的细胞系是转化细胞、会引入新的抗原、无法成功建立永生化细胞系的问题。因此如何克服现有技术的不足是目前细胞技术领域亟待解决的问题。

发明内容

为解决传统的方法存在对于树鼩原代肠上皮细胞系的建立效果不理想、建立的细胞系是转化细胞、会引入新的抗原、无法成功建立永生化细胞系的问题，本发明提供一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，申请人通过大量实验的优化，最终创新性以慢病毒介导转染hTERT基因的前提下，同时不断摸索筛选条件，确定了病毒转染后15天添加筛选剂puromycin 5μg/mL，待对照组细胞全部被杀死后将筛选剂浓度减半，继续培养3代。并且在传代时胰酶消化时间控制在10秒，消化下来的细胞与慢病毒一般操作步骤相比，能够获得阳性的转染细胞，细胞的形态好、活性高，并且通过鉴定表明该细胞为永生化细胞。其次，本发明首次将树鼩肠上皮细胞永生化，获得的永生化细胞保持着原代树鼩肠上皮细胞的生物学特性，能够在被呼肠孤病毒感染后出现明显的细胞病变(CPE)。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：

步骤(1)，慢病毒转染前18-24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×10⁴/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁴/孔；

其中，培养所采用的培养基为完全培养基；

所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2-5％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；