[发明专利]一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），慢病毒转染前18-24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×10⁴/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁴/孔；

其中，培养所采用的培养基为完全培养基；

所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2-5%胎牛血清，1%双抗，1%ITS-G，1%HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；

步骤（2），吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI=10换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养≥72小时，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；

所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1%双抗、1%ITS-G、1%HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；

所述的病毒原液的制备方法为：采用RT-PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液；

所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤（3），往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为2~10μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至70%-90%时，进行传代培养，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。

2.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养15天，作为实验组。

3.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，15天后往加病毒的实验组和未加病毒的对照组中加入嘌呤霉素至终浓度为5μg/mL。

4.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞汇合至70%-90%时，用0.25%胰酶消化传代。

5.根据权利要求4所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞汇合至80%时，用0.25%胰酶消化传代。

6.根据权利要求4所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，消化后再经纯化步骤后传代；

所述的纯化的具体方法为：将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于细胞培养板中，每个孔一个细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，再用0.25%胰酶消化，之后进行传代培养。

7.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，在加入嘌呤霉素前，荧光显微镜检测实验组的ZsGreen荧光表达效率，当荧光表达效率达到80%后再加入嘌呤霉素。

8.权利要求1-7任意一项所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法构建得到的永生化树鼩小肠上皮细胞系。

9.权利要求1-7任意一项所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法构建得到的永生化树鼩小肠上皮细胞系在药物筛选中的应用。