[发明专利]一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及构建方法

说明书

本发明公开一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及构建方法，属于酶工程技术领域。本发明通过菜豆来源的环氧水解酶进行单向定点突变，获得对映选择性与对映归一性提高的突变酶W102L。W102L对外消旋间氯环氧苯乙烷(rac‑mCSO)的最终ee_p，在25℃下从3.1％提高到81.7％。与野生型相比，W102L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac‑pCSO的E值从2.6提高至25.5，对rac‑pCSO的对映选择性提高了9.8倍。

技术领域

本发明涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及构建方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

对映纯对氯环氧苯乙烷(pCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(pCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如R型对氯环氧苯乙烷((R)-pCSO)可以用于合成CB1拮抗剂；R型对氯苯乙二醇((R)-pCPED)是NMDA受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pCSO与pCPED的生物化学方法已经被报道。其中，Suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(R)-pCSO，其ee_p最高可达47％；Karboune等人利用来自重组黑曲霉(Aspergillus niger)的环氧化物水解酶(AnEH)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(R)-pCSO，当转化率达到51％时，ee_s为87％并保留S型底物；Manoj等人使用两种对映选择性互补的EH(StEH与AnEH)协同水解外消旋pCSO合成(R)-pCPED，ee_p达到93％。利用EHs催化制备(R)-pCSO与(R)-pCPED与席夫碱催化合成相比，具有ee_p高，来源清洁，更易分离等优势。

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的EHs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，EHs对外消旋环氧化物的对映选择率E决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ee_s和ee_p。

EHs广泛存在于各生物体中，如真菌、细菌、古生菌、病毒、植物和哺乳动物等。迄今为止，NCBI数据库中收录的EHs基因序列已达数千个。PDB数据库中与EHs晶体结构相关的数据已达两百多条，根据其晶体结构与催化机理的不同，EHs分为三类：(1)α/β水解折叠EHs，例如有微生物来源的ArEH，植物来源的StEH和动物来源的MmsEH；(2)非α/β水解折叠EHs，例如来源于人的LTA₄H；(3)其他类型，例如来源于红串红球菌的LEH。为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，对现有的EHs中进行结构和特性方面的优化显得十分必要。

发明内容

为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，本发明利用定点突变获得了立体选择性提高的PvEH1突变体。本发明采用全质粒PCR的方法对102位色氨酸进行单向定点突变，获得了立体选择性和催化活性同时提高的突变酶W102L，解决了立体选择性不能满足生产高对映纯环氧化物与邻二醇的需求，为拓宽PvEH1的工业应用奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶PvEH1的突变体，所述突变体含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。