[发明专利]一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品

说明书

本发明公开一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品，该方法包括以下步骤：用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒株，在病毒EID₅₀效价达到最高时收获病毒并保存；分别灭活鸡新城疫和禽流感病毒；将灭活后的鸡新城疫和禽流感病毒在吐温‑80中完全混合，得到病毒混合液；在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化配制成二联疫苗。本发明通过采用鸭胚胎干细胞EB66传代细胞系分别进行鸡新城疫和禽流感病毒的培养，然后制备成的二联疫苗具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、产量和质量显著提高等优点。

技术领域

本发明涉及采用全悬浮培养工艺和传代细胞源生产一种鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的方法及其产品，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸡新城疫和禽流感为影响养禽业的最主要的两大传染病，目前，上述两种疫病均可通过疫苗免疫来进行防控。已上市的新城疫和禽流感疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。鸡胚培养存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质。此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。

目前，已经有采用传代细胞系包括MDCK细胞系以及鸡胚传代细胞DF-1细胞系来培养新城疫病毒或禽流感病毒制备疫苗，但是由于上述细胞系表面新城疫病毒和禽流感病毒受体丰度低，造成病毒滴度低，给疫苗的大规模制备造成极大困难。因此，选择一株细胞表面受体丰度高，能够大幅提高新城疫病毒及禽流感病毒生长滴度的细胞株显得尤为重要。更为重要的是，随着养殖业的发展，免疫密度大和免疫强度高成为制约规模化养殖的瓶颈，研制安全高效的联苗成为一种趋势。利用相同的工艺和培养载体(细胞)培养2种或多种疫苗毒显得尤为迫切。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品，该方法具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、可显著提高疫苗产量和质量的优点，利用本发明提供的方法生产出的疫苗具有较高品质，并降低生产成本。

本发明的具体技术方案如下：

一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒株；

(2)在病毒EID₅₀效价达到最高时分别收获鸡新城疫、禽流感病毒并保存；

(3)分别灭活鸡新城疫、禽流感病毒；

(4)将灭活后的鸡新城疫和禽流感病毒在吐温-80中完全混合，得到病毒混合液，在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化，配制成鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。

进一步地，步骤(3)的具体操作如下：在病毒中加入甲醛溶液，充分搅拌并混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，37℃条件下灭活30小时。

进一步地，步骤(4)的具体操作如下：

(a)油相佐剂制备：取注射用白油和司本-80混合，搅拌混匀，灭菌，冷却后备用；

(b)病毒混合液制备：将灭活后的新城疫病毒和禽流感病毒按1:1的比例混合，在混合病毒液中加入灭菌冷却后的吐温-80，充分搅拌至完全溶解，得到病毒混合液；

(c)乳化：在油相佐剂中缓慢加入所述病毒混合液，充分搅拌后乳化。

进一步地，所述油相佐剂与所述病毒混合液的混合体积比为3:2。

进一步地，混合均液与吐温-90的体积为96:4。