[发明专利]一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法

说明书

本发明属治疗糖脂代谢紊乱疾病候选药物的规模化生产技术领域，为解决现有S‑AMP难以生产，其价格昂贵，难以保证其成药性研究的原料来源问题，提供一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，利用pET‑28‑a载体表达N末端带有His‑tag序列的PhAdSS，以此为催化剂催化肌苷酸IMP、L‑天冬氨酸和三磷酸鸟苷GTP，进行反应合成S‑AMP，反应结束后，用硅胶薄层层析分析产物中的成分，进行硅胶柱层析分离纯化S‑AMP。合成品内s‑AMP含量为61%，回收率约20%。制备流程简单，成本低廉，为建立工业化的S‑AMP合成工艺奠定基础。有望突破国外对S‑AMP的垄断性销售，可大幅度降低S‑AMP成药性研究成本。

技术领域

本发明属于治疗糖脂代谢紊乱疾病候选药物的规模化生产的技术领域，具体涉及一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法及其应用。利用深海古细菌来源的酶来催化合成一种天然腺苷类化合物：腺苷酸基琥珀酸(盐)，建立了实验室小试制备方法。这种化合物具有促进胰岛素分泌的功能，可作为改善糖脂代谢紊乱疾病的候选药物开展成药性研究。

背景技术

腺苷酸基琥珀酸(盐)[Adenylosuccinic acid (Adenylosuccinate)，简称S-AMP]是一种促进胰岛素分泌，使Ⅱ型糖尿病患者胰岛细胞恢复正常的功能的天然腺苷类化合物[1]。前期研究中我们发现S-AMP是AMPK的一个激动剂，它的降脂活性高于降糖活性[2]。因此S-AMP可作为改善糖脂代谢紊乱新药的候选品来开展成药性研究。迄今为止，仅有Sigma公司销售S-AMP (纯度96%，价格约100元/mg，现停产)。目前急需研发一种降低药物研发成本且纯度增大的合成方法，降低S-AMP作为改善糖脂代谢紊乱新药的侯选品来开展成药性研究的成本。

生物体内的腺苷酸基琥珀酸(盐) S-AMP合成反应是在腺苷酸基琥珀酸合成酶(AdSS)的催化下，利用肌苷酸(IMP)和L-天冬氨酸和三磷酸鸟苷(GTP)为原料合成S-AMP和二磷酸鸟苷酸(GDP)。由于IMP、L-天冬氨酸和GTP都是价格低廉的生物化工产品，发现活性高，稳定性好，因此寻找到易制备的AdSS就可开展S-AMP的大量合成。前期研究中发现古细菌Pyrococcus horikoshii OT3体内的AdSS (PhAdSS)符合这些要求[2,3]，然而什么样的合成条件能够高效合成S-AMP且得到纯度符合成药性研究要求的分离方法是建立生产工艺的要解决的关键科学问题。

发明内容

本发明为了解决现有腺苷酸基琥珀酸即S-AMP难以生产，其价格昂贵，难以保证其成药性研究的原料来源问题，提供了一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，是利用酶促反应的S-AMP的小试合成及纯化技术，利用PhAdSS建立了S-AMP的小试合成体系，为建立S-AMP的工业化生产工艺奠定了基础。

本发明由如下技术方案实现的：一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，利用大肠杆菌表达体系pET-28-a载体表达N末端带有MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH即His-tag序列的PhAdSS，以此重组蛋白为催化剂催化肌苷酸IMP、L-天冬氨酸和三磷酸鸟苷GTP合成S-AMP和GDP，合成反应结束后，利用硅胶薄层层析分析产物中的成分，根据硅胶薄层层析结果进行硅胶柱层析分离纯化S-AMP，然后采用重结晶法进一步提高产物S-AMP的纯度。

具体制备方法为：