[发明专利]一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备及应用

说明书

本发明公开了一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备及应用，属于水产生物技术中的功能基因突变与应用技术领域。本发明的醛酮还原酶突变蛋白为黄鳝Eakr基因的A81K位点的突变，即黄鳝Eakr基因第81号位氨基酸对应的碱基由GCT突变成了AAG，其对应氨基酸也由丙氨酸突变成赖氨酸。本发明为深入了解黄鳝醛酮还原酶Eakr的功能及其催化四联体在底物识别上的作用提供重要的参考资料，并鉴定突变蛋白的活性及在抑制炎症因子产生中的作用，为进一步挖掘黄鳝醛酮还原酶的功能提供技术方法。

技术领域

本发明属于水产生物技术中的功能基因突变与应用技术领域，具体涉及一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备及应用。

背景技术

醛酮还原酶(aldo-keto reductase，AKR)是一类依赖NADH/NADPH作为辅酶将醛酮类物质还原为相应醇类物质的氧化还原酶。它们在生物界广泛分布，植物、动物和微生物中均有报道。已知的醛酮还原酶数量众多，包括16个家族近200个成员。序列比对分析发现，醛酮还原酶之间具有一定序列同源性，都具有一个典型的(α/β)₈桶状结构。其中，醛酮还原酶负责底物催化的关键氨基酸一般由相对保守的催化四联体(D-Y-K-H)组成。醛酮还原酶底物广泛，包括醛酮类化合物、芳香类化合物、醛糖和类固醇等。

每个醛酮还原酶家族都有其特异性底物，同时在机体内行使独特的生物学功能，例如AKR7家族可以降解致癌羰基化合物，在生物体内参与机体的保护和防御；AKR1C亚家族具有代谢人体性激素的能力，参与人体激素代谢和调节；醛糖还原酶(AR)通过将葡萄糖催化还原成山梨醇，同时减轻果糖和山梨醇在周围组织细胞中的过多积累，从而达到抑制糖尿病的功能。国内外对鱼类醛酮还原酶基因及功能的研究相对匮乏，仅有少数罗非鱼醛酮还原酶AKR1A1羰基解毒作用的报道；代海艳等(2017)初步探明黄鳝醛酮还原酶Eakr具有较好的羰基解毒作用。王全禾等(2017)重组表达了黄鳝醛酮还原酶基因并制备了其多抗，发现其在鱼体中广泛分布，并在多种淡水鱼中具有同源类似物。

醛酮还原酶与肿瘤发生和发展、炎症抑制、糖尿病发生和抑制、性激素调节密切相关(Penning TM，2015)。醛酮还原酶AKR7A3过表达可抑制肿瘤细胞的迁移和发生，并具有抑制NF-kB激活的作用。而对鱼类醛酮还原酶在炎症反应过程中的作用却未可知。鱼类醛酮还原酶在细菌感染过程中的作用是深入了解鱼体天然免疫机制的重要内容。黄鳝醛酮还原酶Eakr的氨基酸序列与已报道的所有醛酮还原酶家族成员同源性均小于25％，且其催化四联体氨基酸为(D-Y-A-H)，这与其他已知醛酮还原酶的催化四联体存在一个氨基酸的差别。其酶学性质尚未可知，其功能亟待鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备方法，通过将黄鳝Eakr第81位丙氨酸(A)进行定点突变为赖氨酸(K)，分析了突变蛋白Eakr^A81K的底物谱，比较野生型(Eakr)和突变型(Eakr^A81K)蛋白对不同代谢底物的活性，为深入了解黄鳝醛酮还原酶Eakr的功能及其催化四联体在底物识别上的作用提供重要的参考资料，并鉴定突变蛋白的活性及在抑制炎症因子产生中的作用，为进一步挖掘黄鳝醛酮还原酶的功能提供技术方法。

通过发明人大量实验和不懈努力，获得了一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白，该醛酮还原酶突变蛋白为黄鳝Eakr基因的A81K位点的突变，即黄鳝Eakr基因第81号位氨基酸对应的碱基由GCT突变成了AAG，其对应氨基酸也由丙氨酸突变成赖氨酸，其突变基因的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备，包括如下步骤：

(1)黄鳝Eakr基因A81K位点的突变