[发明专利]一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备及应用

权利要求书

1.一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白，其特征在于：该醛酮还原酶突变蛋白为黄鳝Eakr基因的A81K位点的突变，即黄鳝Eakr基因第81号位氨基酸对应的碱基由GCT突变成了AAG，其对应氨基酸也由丙氨酸突变成赖氨酸，其突变基因的核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一种黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的制备，其特征在于：包括如下步骤：

(1)黄鳝Eakr基因A81K位点的突变

提取黄鳝总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA，根据黄鳝Eakr基因序列设计突变引物，进行重叠PCR扩增，扩增产物经回收、纯化、连接、转化和测序，黄鳝Eakr基因的第81号位氨基酸对应的碱基由原来的GCT突变成了AAG，其对应氨基酸也由丙氨酸突变成赖氨酸，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

(2)表达载体构建及重组蛋白表达和纯化

步骤A、将步骤(1)所得PCR产物与原核表达载体pET-28a(+)同时进行EcoRI和Hind III双酶切，回收、纯化、连接和转化，并在含有卡那霉素的平板上进行抗性筛选，经测序验证后，成功构建原核表达载体PET-Eakr^A81K；

步骤B、将原核表达载体pET-Eakr^A81K转化E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素平板上进行抗性筛选，并经菌落PCR验证及SDS-PAGE电泳检测获得阳性表达菌株；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有卡那霉素的培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白，实现了突变体蛋白Eakr^A81K的纯化。

3.一种如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的应用，其特征在于，该突变蛋白可用于检测醛类物质及中长链酮类物质的还原活性。

4.一种如权利要求1所述的黄鳝醛酮还原酶突变蛋白的应用，其特征在于，该突变蛋白能够抑制LPS诱导的肝脏组织IL-1β基因的表达水平，可抑制炎症因子的产生。