[发明专利]用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)捕获单元制备

a.制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液：将0.7～1.0g FeCl₃·6H₂O和0.2～0.5g FeCl₂·4H₂O溶于50～100mL水，通氮除氧，搅拌混合均匀，升温到80～100℃，缓慢滴加20～25wt％氨水，调节pH＝9～10，继续加热搅拌1～2h后，停止加热，在氮气保护下，搅拌回流，冷却至室温，水清洗至中性，乙醇定容至50mL，即得Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液；

b.制备氨基化Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液：将40～50mL Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液超声0.5～1h，加入0.2～0.3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌4～5h，加入1～2mL 0.1～0.5mol/L硝酸溶液，继续搅拌3～4h，水清洗至中性，乙醇定容至100mL，即得氨基化Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液；

c.制备Fe₃O₄@Au磁性纳米颗粒溶液：将5～10mL氨基化Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液和10～20mL 1wt％HAuCl₄溶液在60～100kHz的超声频率下混合，搅拌1h后，缓慢加入30～50mL 20～30mmol/L柠檬酸三钠溶液，超声2～3h，水清洗至中性，乙醇定容至20mL，即得Fe₃O₄@Au磁性纳米颗粒溶液；

d.制备捕获单元溶液：取50～100μL Fe₃O₄@Au磁性纳米颗粒溶液超声5～10min，加入20～50μL 1～5μmol/L捕获探针溶液，用DNA固定液定容至200μL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h，利用Au-S键合作用，捕获探针自组装在Fe₃O₄@Au磁性纳米颗粒的表面，清洗；滴加10～20μL 10～20mmol/L巯基己醇溶液封闭非特异性吸附位点，清洗；用缓冲液定容至100μL，即得捕获单元溶液；

(2)信号单元制备

a.制备金纳米颗粒溶液：取10～20μL四羟甲基氯化磷加入到50～60mL 6～7mmol/LNaOH溶液中，搅拌5min，加入1.8～2.0mL 1wt％HAuCl₄溶液，溶液颜色由亮黄色变为紫黑色再变为酒红色，继续搅拌30min，置于4℃冰箱密封避光保存，陈化2周，即得金纳米颗粒溶液；

b.制备氨基化SiO₂纳米颗粒溶液：取2～3mL正硅酸乙酯加入到40～60mL乙醇中，再加入3～4mL水、3～4mL 10～20wt％氨水和40～50mL乙醇，混合均匀，室温下反应20h，水清洗，乙醇定容至50mL，得到SiO₂纳米颗粒溶液；取10mL SiO₂纳米颗粒溶液，加入100～120μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，混合均匀，80℃下烘箱中反应2h，冷却之后，超声0.5h，离心清洗，用水定容至10mL，得到氨基化SiO₂纳米颗粒溶液；

c.制备二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液：取100～120μL氨基化SiO₂纳米颗粒溶液，加入到50～60mL金纳米颗粒溶液中，搅拌2h，清洗，水定容至20mL，即得二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液；

d.制备空心金纳米球溶液：称取10～15mg K₂CO₃溶于40～50mL水中，搅拌5min后，逐滴加入0.8～1.0mL 1wt％HAuCl₄溶液，继续搅拌，溶液由黄色逐渐变为无色，得到K₂CO₃-HAuCl₄生长液；取40～50mL K₂CO₃-HAuCl₄生长液，加入0.5～1.0mL二氧化硅/金纳米复合颗粒溶液，搅拌5min，加入0.3～0.5mL 0.1mol/L H₂O₂溶液，继续搅拌30min，溶液由粉红变紫色再变蓝色最后深红色，离心清洗，水定容至20mL，得到金纳米壳溶液；取5～6mL金纳米壳溶液，加入2～3μL 0.02mol/L氢氟酸，缓慢搅拌，离心清洗，水定容至20mL，得到空心金纳米球溶液；

e.制备信号单元溶液：取300～400μL空心金纳米球溶液，超声10min，加入5～10μL 5～10μmol/L引发探针溶液，用DNA固定液定容至500μL，混合均匀，37℃下震荡3～4h，暗处放置24h后，加入发卡DNA 1和发卡DNA 2，37℃下孵育2～3h，进行HCR扩增，离心清洗，缓冲液定容500μL，得到HGNs/HCR溶液；取400～500μL的HGNs/HCR溶液，加入5～10μL 5～10mmol/LAgNO₃溶液，反应20min，Ag⁺吸附到HGNs表面和DNA双链中，加入10～20μL 10～20mmol/L氢醌溶液，反应30min，吸附的Ag⁺被还原为银纳米颗粒，缓冲液清洗，定容至500μL，得到AgNPs@HGNs/HCR溶液；取400～500μL的AgNPs@HGNs/HCR溶液，加入5～10μL 0.5～1.0mmol/L罗丹明6G溶液，孵育2～3h，缓冲液清洗，即得信号单元溶液；

(3)SERS生物传感器制备

取5～10μL捕获单元溶液，加入5～10μL一定浓度的miRNA-141溶液，在37℃下孵育2h后；加入5～10μL信号单元溶液，并在37℃下孵育2h；清洗，并用磁铁进行分离，反复三次，得到用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器，其中所述的捕获探针的核苷酸序列为：5’-GAA AGC CCA TCT TTA CCA GAC AGT GTT AGG TTT GGC TTT C-3’；所述的引发探针的核苷酸序列为：5’-SH-CGG CGA TAA CAA GAA AGC CAA ACC-3’；所述的发卡DNA 1的核苷酸序列为：5’-TAA CAA GAA AGC CAA ACC GAG ATG GGT TTG GCT TTC TTG TTA TCG CCG-3’；所述的发卡DNA 2的核苷酸序列为：5’-CAT CTC GGT TTG GCT TTC TTG TTA CGG CGATAA CAA GAA AGC CAA ACC-3’；所述的miRNA-141的核苷酸序列为：5’-UAA CAC UGU CUGGUA AAG AUG G-3’。

2.根据权利要求1所述的用于检测肿瘤标志物miRNA-141的SERS生物传感器的制备方法，其特征在于所述的DNA固定液的配方如下：10mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA，10mmol/L三(2-羧乙基)膦和0.1mol/L NaCl，pH为7.6～8.0；所述的缓冲液的配方如下：10mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA，0.3mol/L NaCl和1mmol/L MgCl₂，pH为7.6～8.0。