[发明专利]一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游IVF145：GGAGCATTGAAGTTGGATAC；下游IVR961：GAAGGATGGATACAACAACA；内引物：上游IVF300：AGTAATCGGCAGTCATCAC；下游IVR646：GGTGAATGGTGGTCTTATCC。本发明基于常规PCR的操作方法和仪器设备，但比常规PCR方法具有更高的检测灵敏性和特异性，大幅增加了对虾虹彩病毒隐性感染时的病原检出率，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。本发明对检测的仪器设备和操作技能要求较低，利于在基层单位和养殖企业应用与推广。

技术领域

本发明属于对虾虹彩病毒疾病检测领域，特别涉及一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒。

背景技术

虹彩病毒宿主多、分布范围广，是已知水生动物病毒中危害较为普遍的一种病毒,在世界范围内引起的水生动物高发病率和高死亡率现象给水产业造成了重大经济损失。虹彩病毒科共分5个属，其中，虹彩病毒属和绿虹彩病毒属主要感染无脊椎动物。近两年调查研究发现，我国养殖对虾普遍存在虹彩病毒感染。养殖日本囊对虾和凡纳滨对虾的虹彩病毒感染率均在10％以上，流行地区野生日本囊对虾的虹彩病毒感染率更是高达50％以上，预示着很高的养殖和放流风险。

常规的病毒检测技术如组织病理、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次确诊等缺点，而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量极小的特点，特别适用于育苗亲虾的筛选(损伤小)和放流虾苗的病原监测。而在常规PCR基础上发展起来的套式PCR技术，则具有更高的灵敏性，可大幅提高病原检出率。只需要一台普通PCR仪，即可获得近似实时荧光定量PCR的检测灵敏性。因此，建立对虾虹彩病毒套式PCR检测技术，不仅可监测到对虾虹彩病毒的微量潜伏感染，实现对对虾虹彩病毒病的早期预警，而且对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，检测成本也较低，利于在基层单位和养殖生产一线应用与推广。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，该试剂盒比常规PCR方法具有更高的灵敏度和特异性，大幅提高了病毒微量感染时对虾虹彩病毒的检出率，而对设备和人员技术要求较低，因此，适用于对虾虹彩病毒微量隐性感染时期的监测和虹彩病毒病的早期预警，利于在基层单位与养殖企业应用和推广。

本发明提供了一种对虾虹彩病毒套式PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两对特异性引物：外引物：上游IVF145：5'-GGAGCATTGAAGTTGGATAC-3'，下游IVR961：5'-GAAGGATGGATACAACAACA-3'；

内引物：上游IVF300：5'-AGTAATCGGCAGTCATCAC-3'，下游IVR646：5'-GGTGAATGGTGGTCTTATCC-3'。

所述试剂盒第一轮反应总体积50μl体系，其中，Hot start DNA polymerase(5U/μl)0.25μl，10×Hot start DNA polymerase buffer(Mg2+20mM)5μl，dNTPs(各2.5mM)4μl，IVF145(10μM)1μl，IVR961(10μM)1μl，DNA模板2μl，dd H2O 36.75μl；第二轮反应总体积50μl体系，其中，Hot start DNA polymerase(5U/μl)0.25μl，10×Hot start DNA polymerasebuffer(Mg2+20mM)5μl，dNTPs(各2.5mM)4μl，IVF300(10μM)5μl，IVR646(10μM)5μl，第一轮PCR扩增产物2μl，dd H2O 28.75μl。