[发明专利]使用双功能PNA探针进行熔解曲线分析的方法、以及使用所述方法诊断微卫星不稳定性的方法和诊断微卫星不稳定性的试剂盒

说明书

本发明涉及使用双功能PNA探针进行熔解曲线分析的方法、以及使用所述方法诊断微卫星不稳定性的方法和诊断微卫星不稳定性的试剂盒。更具体地，本发明涉及：通过使用能够与相同碱基发生重复的区域特异性结合的荧光PNA探针根据缺失的碱基突变的数量以不同的键合强度结合的荧光PNA探针的结构进行熔解曲线分析的方法；以及通过所述分析方法和通过分析作为结果发生的碱基突变的数量检测相同碱基发生重复的区域中碱基缺失产生的微卫星标记物中的基因突变能够快速准确地确定微卫星不稳定性的诊断方法。根据本发明，通过使用准基因座中具有高灵敏度和特异性的五个微卫星标记物，可以分析微卫星标记物基因是否已以高灵敏度缺失，因此，与现有的MSI诊断方法相比，可以降低成本并且可以减少检查所需的时间。

技术领域

本发明涉及使用双功能荧光PNA探针分析熔解曲线的方法、使用所述方法诊断微卫星不稳定性(MSI)的方法和诊断微卫星不稳定性(MSI)的试剂盒。更具体地，本发明涉及使用能够与相同碱基发生重复的区域特异性结合的荧光PNA探针依赖于缺失的碱基突变的数量基于以不同的结合力结合的荧光PNA探针的结构来分析熔解曲线的方法；以及通过使用所述分析方法检测相同碱基发生重复的区域中碱基缺失引起的微卫星标记物的基因突变并分析由此获得的碱基突变的数目，快速准确地检测和分析微卫星不稳定性(MSI)的方法。

背景技术

微卫星是指重复性遗传序列的轨迹，其中六个或更少的短DNA碱基序列在整个人类基因组中按顺序重复地排列。它们在各自的染色体上以不同的重复分布。

微卫星不稳定性(MSI)是指由构成微卫星的短串联重复序列的增加或减少引起的长度变化性，其通过错配修复基因(MMR基因)经历恢复过程。然而，由启动子甲基化、DNA错配修复(MMR)基因的种系突变等引起的恢复异常可能改变微卫星的长度。通过检测这种微卫星不稳定性可以诊断基因修复异常。这种MSI首次是在患有遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)综合征的患者中发现的。据报道，约90％的HNPCC患者具有MSI。此外，MSI被发现在多种其他肿瘤中，特别地，MSI(+)在子宫内膜癌中以75％或更高的高发生率表达，其最常见发生于患有遗传性非息肉性结直肠癌综合征的患者中。MSI(+)被发现存在于没有遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)等家族史的偶发性结直肠癌和偶发性子宫内膜癌中。具体地，例如，据不同的报道，在其他国家，MSI(+)在偶发性子宫内膜癌中的发生率达到约10％至40％，而在韩国，MSI(+)在偶发性子宫内膜癌中的发生率达到约20％至24％。最近，据报道，MSI型结肠癌和胃癌患者对免疫治疗有良好的预后，因此越来越需要将微卫星不稳定性测试作为免疫治疗剂的生物标记物(Le等人,N Engl J Med.372.26:2509-2520,2015；Cristescu等人,Nature Medicine 21.5:449-456,2015)。

根据国际标准，MSI一般分为两种类型。美国国家癌症研究所(NCI)在1997年提出了五种微卫星标记物(BAT-25、BAT-26、D2S123、D17S250和D5S346)，包含两种单核苷酸重复微卫星和三种二核苷酸重复微卫星。两个或更多个标记物显示不稳定性的情况对应于高水平MSI(MSI-H)，其中40％或更多的微卫星标记物具有微卫星不稳定性，其也称为“复制错误阳性(RER+)”。仅一个标记物显示不稳定性的情况对应于低水平MSI(MSI-L)，其中40％或更少的微卫星标记物具有微卫星不稳定性。没有微卫星不稳定性的情况被定义为微卫星稳定性(MSS)。(Boland等人,Cancer Res.,58:5248-57,1998；Kim,Duekwoo,Journal ofGenetic Medicine 7:24-36,2010)。