[发明专利]降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法

权利要求书

1.在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法，其包括：

步骤(a)，制备分别包含正向引物及反向引物的至少三个引物对，上述每个引物对包含与对应的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列，上述至少一个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物，上述通用碱基引物具有1～3个通用碱基核苷酸，上述通用碱基核苷酸中的一个或两个位于在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第六个核苷酸范围的核心区域，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第七个核苷酸的范围内，使用上述至少三个引物对的多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物，上述通用碱基核苷酸在通用碱基引物具有非连续性；

步骤(b)，使用上述至少三个引物对进行包括引物退火、引物延伸及变性的至少两次循环的多重扩增反应，上述多重扩增反应通过降低的引物二聚体形成来生成靶核酸分子的扩增产物。

2.权利要求1的方法，其中所述核心区域为在通用碱基引物的3’-末端中的第三个核苷酸至第五个核苷酸的范围，其余位于在通用碱基引物的5’-末端中的第四个核苷酸至在通用碱基引物的3’-末端中的第六个核苷酸的范围的区域内。

3.权利要求1的方法，其中所述至少一个引物对中的两个引物为通用碱基引物。

4.权利要求1的方法，其中每个引物对中的一个或两个引物为通用碱基引物。

5.权利要求1的方法，其中所使用的引物的总数中的50％为通用碱基引物。

6.权利要求1的方法，其中所述通用碱基引物中的至少一个不包含多义碱基。

7.权利要求1的方法，其中至少五个引物对使用于至少五个靶核酸分子的扩增。

8.权利要求1的方法，其中在上述多重扩增反应中，在50℃以上的温度下进行引物退火。

9.权利要求1的方法，其中相比于使用包含与上述靶核酸序列互补的自然产生核苷酸的引物来代替上述至少一个通用碱基引物时，在多重扩增反应中通过降低的引物二聚体形成来扩增至少三个靶核酸分子的方法产生至少高3％的靶扩增效率，其中所述自然产生核苷酸是A、C、G或T/U。

10.权利要求1的方法，其中在不存在靶核酸分子的条件下从使用包含通用碱基引物的引物对的反应获得的Ct值相比于在不存在靶核酸分子的条件下从使用由以往的引物组成的引物对的反应获得的Ct值增加1以上。

11.权利要求1的方法，其中为了检测上述靶核酸分子的存在而在存在至少三个额外的探针的条件下进行上述多重扩增反应，每个上述至少三个探针包含与需要扩增的靶核酸分子有关的杂交核苷酸序列且位于正向引物及反向引物之间。

12.权利要求11的方法，其中所述至少三个探针不具有通用碱基核苷酸。