[发明专利]DNA分子的酵母细胞提取物辅助构建

权利要求书

1.一种将多个双链DNA片段组合成DNA分子的方法，所述方法包括：在单一体外反应中将所述多个双链DNA片段与酵母菌株的无细胞提取物接触，以将所述多个DNA片段组合成所述DNA分子，其中每个所述DNA片段具有5'末端和3'末端，并且其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp同源时，所述DNA片段彼此组装。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过以下方式获得所述DNA片段：通过用一种或多种限制酶消化染色体DNA；通过PCR扩增DNA；通过化学合成；或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段从单个基因组、两个或多个基因组、突变DNA或改组DNA中获得。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA片段的来源是基因组DNA、cDNA、半合成DNA、合成DNA或其任何组合。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述DNA片段与线性化质粒或载体组合以产生DNA文库。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述DNA文库是突变DNA文库。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述酵母菌株是酵母属菌株。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述酵母属菌株是酿酒酵母。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少100bp、或至少200bp同源时，所述DNA片段彼此组合。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其中在不添加一种或多种选自由以下组成的组的外源酶的情况下进行所述体外反应：外源DNA限制酶、外源DNA修饰酶、外源DNA连接酶和外源DNA聚合酶。

11.如权利要求1至10任一项所述的方法，其中在将所述DNA片段组装成DNA分子之前，将同源区侧翼多达至少1000bp的非同源序列去除。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：将所得DNA分子转化到宿主细胞中，并分离包含所述DNA分子的单菌落转化体。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌菌株。

14.如权利要求12或13所述的方法，所述方法进一步包括：从所述单菌落转化体中回收DNA分子。

15.如权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括：将所述回收的DNA分子转化到宿主细胞中，并选择转化体。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述回收的DNA分子与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列指导产生由所述DNA分子编码的具有目的生物活性的多肽。

17.如权利要求15或16所述的方法，所述方法进一步包括：在适合产生所述具有目的生物活性的多肽的条件下培养所述转化体。

18.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括：回收所述具有目的生物活性的多肽。