[发明专利]用于体外糖工程化抗体的酶的再使用

说明书

本文报道了酶促制备/产生在Fc区中具有修饰的糖基化的抗体的方法，其包括以下步骤：将在Fc区具有糖基化的抗体与一种或者多种酶孵育足够的时间，并且在适于修饰Fc区的糖基化为确定形式的条件下孵育，在一个或多个色谱步骤中分离在Fc区中具有修饰的糖基化的抗体和一种或者多种酶，从而产生在Fc区具有修饰的糖基化的抗体，和一种或多种再循环酶，并用一种或多种再循环酶重复孵育步骤至少一次。

本发明属于抗体工程的领域。在本文中更详细地报道了用于抗体Fc区中的糖基化的体外糖工程化方法，其中回收所使用的酶并再使用。

背景技术

IgG是最丰富的抗体同种型，其中IgG1抗体是表现出最显著程度和效应功能组(array)的亚类。IgG1抗体是免疫疗法中最常用的抗体，其中ADCC和CDC通常被认为是重要的。在抗体结构内，CH2结构域以及IgG铰链区在Fc介导的抗体效应功能中起主要作用。每个CH2结构域包含位于约297位的天冬酰胺残基处的保守糖基化位点(根据Kabat的EU索引编号)，其中聚糖部分共价结合(Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。在成熟IgG分子中，聚糖埋在CH2结构域之间，影响IgG分子的三级结构。

抗体Fc区的聚糖主要是高度异质的复合双触角结构。虽然抗体的Fab区内可能存在其他非保守的糖基化位点，但抗体糖基化对其效应功能的影响已归因于Fc区糖基化。

已知抗体Fc区中存在的N-连接聚糖对于抗体介导效应功能如ADCC是必需的(Lively,M.R.等人Glycobiol.8(1995)813-822；Jefferis R.等人Immunol Rev.163(1998)59-76)。已经显示N-连接聚糖的组成影响IgG分子的Fc区结构，从而改变抗体效应功能，如Fc-受体结合、ADCC活性和CDC活性(Presta,L.,Curr.Opin.Struct.Biol.13(2003)519-525)。

在重组表达系统中表达的(例如，通过在原核或真核宿主细胞中表达)IgG抗体中，N-连接的聚糖结构在各个抗体分子之间是不同的。因此，在重组表达系统中产生的抗体可以被认为是“抗体群”(文中进一步使用的术语)，其中抗体的氨基酸序列相同但是在其Fc区的N-连接聚糖模式中表现出异质性。

已知Fc区聚糖的组成在用于表达重组抗体的不同宿主细胞物种之间是不同的。用于重组表达抗体的两种常用宿主细胞系是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和小鼠骨髓瘤细胞(例如sp2/0、P3X63Ag8.653、NSO)。CHO细胞表达重组抗体，其基本上没有末端唾液酸残基，而大部分聚糖模式是岩藻糖基化。相反，小鼠骨髓瘤细胞产生的抗体群具有高达50％(相对频率)的唾液酸残基但具有较少的岩藻糖残基。

已知聚糖结构的一些末端残基影响IgG效应功能。已知末端岩藻糖残基的存在有助于降低FcγRIIIa结合和降低ADCC。因此，缺乏末端岩藻糖残基的抗体(“非岩藻糖基化(afucosylated)”抗体)与抗体群介导的ADCC增加相关。虽然非岩藻糖基化对ADCC介导的改善的影响在本领域中已被广泛接受，但是Fc区域半乳糖基化在ADCC介导中的作用是有争议的。一些研究表明半乳糖基化对ADCC没有影响(Boyd,P.N.,等人Mol Immunol.32(1995)1311-1318；Hodoniczky,J.,等人Biotechnol.Prog.21(2005)1644-1652；Raju,T.S.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)471-478)；而其他研究则报道了IgG的半乳糖基化增加FcγRIIIa结合(Houde,D.,等人,Mol.Cell.Proteom.9(2010)1716-1728；Kumpel,B.M.,等人,Hum.Antibod.Hybridom.6(1995)82-88；Thomann,M.,等人,Mol.Immunol.73(2016)69-75)。