[发明专利]用于体外糖工程化抗体的酶的再使用

权利要求书

1.一种酶促产生在N-糖基化位点上具有修饰的糖基化的抗体的方法，其包括下述步骤：

a)将在N-糖基化位点具有糖基化的抗体与一种或者多种酶(和一种或者多种活化的糖残基)孵育足够的时间，并且在适于修饰N-糖基化位点(至确定形式)的糖基化的条件下孵育，

b)在一个或者多个色谱步骤中分离在N-糖基化位点具有修饰的糖基化的抗体和一种或者多种酶，从而i)产生在N-糖基化位点具有修饰的糖基化的抗体和ii)获得一种或者多种再循环的酶，和

c)用步骤b)的一种或者多种再循环酶重复步骤a)至少一次。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育在溶液中或与抗体(轻链或Fc区)亲和配体结合的抗体孵育。

3.根据在先权利要求任一项所述的方法，其中在步骤b)中，通过阳离子交换色谱法将在N-糖基化位点处具有修饰的糖基化的抗体与一种或多种酶分离。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一种或者多种酶是半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述半乳糖基转移酶是β4GalT1。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中唾液酸转移酶是ST6。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中阳离子交换色谱法包括以下步骤：

i)将包含半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶和在N-糖基化位点具有修饰的糖基化的抗体的溶液施加到阳离子交换色谱材料，

ii)任选地洗涤阳离子交换色谱材料(从阳离子交换色谱材料中除去未结合的化合物，而不洗脱在N-糖基化位点具有修饰的糖基化的抗体)，

iii)将第一溶液施加到阳离子交换色谱材料，从而(如果存在)，从阳离子交换色谱材料中洗脱半乳糖基转移酶，

iv)将第二溶液施加到阳离子交换色谱材料，从而从阳离子交换色谱材料中洗脱在N-糖基化位点具有修饰的糖基化的抗体，和

v)将线性(盐)梯度施加到阳离子交换色谱材料，从而(如果存在)，从阳离子交换色谱材料中洗脱唾液酸转移酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中

-步骤i)的溶液是2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液，其pH值为pH5.0至pH6.5，

-步骤ii)的溶液是2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液，其pH值为pH5.0至pH6.5，

-步骤iii)的溶液是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液，其pH值为pH6.6至pH8.0，

-步骤iv)的溶液是2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液，其pH值为pH5.0至pH6.5，其包含约75mM至约125mM氯化钠(NaCl)，和

-线性梯度是从步骤iv)的溶液到2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液，pH值为pH5.0至pH6.5，包含约750mM至约1250mM氯化钠(NaCl)。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中重复是1-3次。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中阳离子交换色谱材料具有交联琼脂糖和磺丙基阳离子交换基团的基质。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，所述抗体是二价单特异性抗体或二价双特异性抗体或抗体Fab片段。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化或人抗体。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗体是人IgG1或IgG4亚类的抗体。