[发明专利]用于进行多重PCR的方法

说明书

本发明描述了使用标记的水解探针进行更高的多重PCR以检测和定量靶核酸的方法。

发明领域

本发明涉及聚合酶链式反应(PCR)的方法，特别涉及进行多重PCR的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)已成为生物医学研究，疾病监测和诊断的普遍工具。通过PCR扩增核酸序列描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中。PCR现在是本领域众所周知的并且已在科学文献中广泛描述。参见PCR Applications, ((1999) Innis等人编辑，Academic Press, San Diego)；PCR Strategies, ((1995) Innis等人编辑，Academic Press, San Diego)；PCR Protocols, ((1990) Innis等人编辑，AcademicPress, San Diego)，和PCR Technology, ((1989) Erlich编辑，Stockton Press, NewYork)。

“实时”PCR测定能够同时扩增和检测并定量靶序列的起始量。典型实时PCR方案涉及使用对每种靶序列特异性的标记探针。探针优选用一个或多个荧光部分标记，所述荧光部分吸收并发射特定波长的光。在与靶序列或其扩增子杂交后，探针由于探针杂交或水解而表现出可检测的荧光发射变化。

然而，PCR测定的主要挑战仍然是分析单个管中的多种靶标的能力。在几乎每个医学和诊断领域，目标基因座数量迅速增加。例如，在法医DNA概况分析，病原微生物检测，多基因座遗传疾病筛查和多基因表达研究(仅举几例)中，必须分析多个基因座。

使用大多数现有方法，多重测定的能力受到检测仪器的限制。具体地，在相同反应中使用多个探针需要使用不同的荧光标记。为了同时检测多个探针，仪器必须能够区分每个探针发出的光信号。市场上的大多数现有技术不允许在同一反应容器中检测超过四到七个单独的波长。因此，每种靶标使用一个独特标记的探针，在同一个容器中可以检测到不超过四到七个单独的靶标。在实践中，至少一种靶标通常是对照核酸。因此，在实践中，在同一管中可以检测到不超过三到六个实验靶标。由于光谱宽度，荧光染料的使用也受到限制，其中在可见光谱内仅可容纳约六或七种染料而没有显著的重叠干涉。因此，除非进行扩增和检测策略的根本改变，否则多重测定的能力将不能跟上临床需要。

通过PCR后解链测定提供了使扩增反应多重化的额外能力。参见2006年6月23日提交的美国专利申请序列号11/474,071。在解链测定中，扩增的核酸通过其独特的解链曲线来鉴定。解链测定包括测定双链靶标或标记的探针和靶标之间的双链体的解链温度(解链点)。如美国专利号5,871,908中所述，为了使用荧光标记的探针确定解链温度，在温度受控程序中逐渐加热(或冷却)靶核酸和探针之间的双链体。双链体的解离改变了相互作用的荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的距离。相互作用的荧光团可以与分开的探针分子缀合，如美国专利号6,174,670中所述。或者，一个荧光团可以与探针缀合，而另一个荧光团可以插入核酸双链体中，如美国专利号5,871,908中所述。作为又另一种替代方案，荧光团可以与单个探针寡核苷酸缀合。在双链体解链后，荧光被猝灭，因为荧光团与猝灭剂在现在的单链探针中聚集在一起。

通过测量相关的荧光变化来监测核酸双链体的解链。荧光的变化可以在称为“解链曲线”的图上表示。因为不同的探针-靶标双链体可以设计成在不同温度下解链(或再退火)，每个探针将产生独特的解链曲线。正确设计的探针将具有与同一测定中其他探针的解链温度明显不同的解链温度。许多现有的软件工具使人们能够在考虑这些目标的情况下设计用于同管多重测定的探针。例如，Visual OMP^TM软件(DNA Software, Inc., Ann Arbor,Mich)使人们能够确定核酸双链体在各种反应条件下的解链温度。