[发明专利]用于基因组改造的杂合核酸序列

说明书

本发明涉及含以共价和/或非共价方式彼此相联的CRISPR核酸序列和DNA修复模板的杂合核酸序列构建体，其用于基于CRISPR的基因组改造。还提供另外含至少一个CRISPR多肽的分子复合物。复合物内的所有组分在物理位置上接近。另外，提供植物、植物细胞、植物材料、或其衍生物或后代，其包括所述杂合RNA/DNA序列和/或分子复合物。此外，提供在原核或真核细胞中修饰至少一个DNA靶序列的方法以及产生植物或植物细胞的方法。最后，提供至少一个杂合DNA/DNA核酸序列或分子复合物在原核或真核细胞或生物体内基因编辑或基因组改造中的应用。

技术领域

本发明涉及包含以共价和/或非共价方式彼此相联的CRISPR核酸序列和DNA修复模板核酸序列的杂合核酸序列构建体，从而通过增加DNA双联断裂位点周围的修复模板局部可用性，提供基于CRISPR的基因编辑或基因组改造的灵活稳定工具。还提供另外含至少一个CRISPR多肽的分子复合物，从而复合物内的所有组分在物理位置上接近并因而在要以靶向和控制方式修饰的DNA靶序列位点容易原位可用。另外，提供植物、植物细胞、植物材料、或其衍生物或后代，其包括杂合RNA/DNA序列和/或分子复合物或由杂合RNA/DNA序列和/或分子复合物编辑。基于这些工具，提供在原核或真核细胞中修饰至少一个DNA靶序列的方法以及产生植物或植物细胞的方法。最后，提供至少一个杂合DNA/DNA核酸序列，或含彼此相连的CRISPR RNA、修复模板DNA和CRISPR多肽序列的分子复合物，在原核或真核细胞或生物体内，优选在植物细胞或生物体内基因编辑或基因组改造中的应用。

发明背景

精确的基因编辑或基因组改造已演变为遗传工程最重要的领域之一，允许靶向和定点操作感兴趣基因组。定点基因组改造的一个必不可少条件是可编程核酸酶，其能用于在确定位置使感兴趣核酸断裂以诱导双链断裂(DSB)或者一个或多个单链断裂。后者，所述核酸酶可以是嵌合或突变变体，不再包括核酸酶功能，而是作为识别分子与另一酶联合操作。这些核酸酶或其变体因而是任何基因编辑或基因组改造方法的关键。近年来，开发了许多合适的核酸酶尤其是定制的内切核酸酶，包括大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶和CRISPR核酸酶，包含例如Cas或Cpf1核酸酶作为成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统的一部分。

在其天然环境内的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)最初于细菌中进化，其中，CRISPR系统起到适应性免疫系统的作用以抵抗病毒攻击。暴露于病毒后，病毒DNA的短区段整合入CRISPR基因座。RNA转录自含病毒序列的部分CRISPR基因座。含有病毒基因组互补序列的RNA调节CRISPR效应蛋白靶向病毒基因组中的靶序列。CRISPR效应蛋白切割并因而干扰病毒靶标复制。过去的几年中，CRISPR系统也在真核细胞内成功地适应基因编辑或基因组改造。动物细胞中的编辑和人类的治疗应用目前是重要的研究方向。复杂动物以及植物基因组的靶向修饰仍代表一项艰巨的任务。