[发明专利]利用信号变化量数据集的样品内的目标分析物质检测方法

说明书

本发明涉及利用信号变化量数据集及上述信号变化量数据集的重建的数据集来检测样品内的目标分析物质的方法。根据本发明，用于如基线化或平滑的目标分析物质检测的数据集修改能够不经过如基线区域设定的复杂步骤简单进行。

技术领域

本发明涉及利用信号变化量数据集的样品内的目标分析物质检测方法。

背景技术

被公知为聚合酶链反应(Polynucleotide chain reaction，PCR)的广泛使用的核酸扩增反应包括双链DNA的变性、在DNA模板寡核苷酸引物的退火及基于DNA聚合酶的引物延伸的反复周期过程(Mullis等，美国专利第4683195号，第4683202号及第4800159号；Saiki et al.，(1985)Science 230，1350-1354)。

实时聚合酶链反应(Real time PCR)为在样品实时检测目标核酸的聚合酶链反应技术。为了检测特定目标核酸，实时聚合酶链反应利用当聚合酶链反应反应时，与目标核酸的量成比率来释放可检测的荧光信号的信号发生单元。荧光信号的发生利用包含向双链DNA之间插入的嵌入剂或报道基因及淬灭分子的寡核苷酸来实现。与目标核酸的成比率的荧光信号通过实时聚合酶链反应在各个测定位置(周期)检测，从而获取包含各个测定位置及上述测定位置中的信号值数据集，从上述数据集获取表示对测定位置检测的荧光信号的强度的扩增曲线(amplification curve)或扩增轮廓曲线(amplification profilecurve)。

通常，基于实时聚合酶链反应的扩增曲线区分为基线(baseline)区域、指数(exponential)区域、直线(linear)区域及停滞(plateau)区域。指数区域为与聚合酶链反应扩增产物的增加成比率来释放的荧光信号增加的区域，直线区域为荧光信号的增加实质上减少，从而实质上呈线形，停滞区域为聚合酶链反应扩增产物的增加及荧光信号的释放处于饱和状态，从而无法再次呈现荧光信号的增加的区域。

基线区域为反应初期信号水平没有变化地恒定维持的区域。上述区域中，聚合酶链反应反应产物所释放的荧光信号并不充分至可以检测，因此，与基于目标分析物质的扩增的荧光信号相比，反应样品自身的荧光信号和测定系统的自身荧光信号的背景信号(background signal)占据上述区域的荧光信号的大部分。

如噪声的发生、基线的歪曲或变动的问题的原因在于设备之间、设备内信号水平的偏差、退火温度的变化等实验条件的变化及反应混合物内气泡的发生。这种噪声或基线的歪曲或变动在目标分析物质的分析过程中呈现出假阳性或假阴性结果。为了与目标分析物质有关的数据集的准确且再现性分析，需要从扩增曲线或数据集去除背景信号的基线化过程及修改非正常信号的过程。

根据以往的目标分析方法，基线化过程确定与各个样品的基线区域及基线相对应的数据集，并去除上述基线区域的背景信号。尤其，基线区域的确定通过基线区域的第一位置及最后位置确定。因此，准确确定基线区域的第一位置及最后位置极为重要。

开发了与基线区域的确定有关多种方法。Woo等揭示了利用扩增区间的lowerbound来确定基线区域的方法(美国公开公报2007/0192040)。Lerner等揭示了将扩增曲线微分之后，将具有设定的阈值以上的第一次微分峰值的起始点设定为基线区域的末端位置来确定基线区域的方法(美国专利7720611)。

但是，这种现有技术具有局限或缺点。根据以往的方法，在基线区域发生的噪声或非正常信号对基线确定产生影响。尤其，在基线区域的起始位置或结束位置通过噪声或非正常信号确定的情况下，使用基线的线性规划函数的基线化过程对上述噪声或非正常信号产生很大的影响。

为了防止这种错误而设定规定水平，提出与上述以往相对应的信号确定噪声或非正常信号来去除或回避上述噪声或非正常信号的多种方法。