[发明专利]用于增强PKLR的基因表达的组合物和方法

说明书

本公开提供了用于在哺乳动物细胞中表达基因以便为丙酮酸激酶缺乏症提供基因疗法的多核苷酸盒、表达载体和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年4月20日提交的美国临时申请号62/325,397的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及丙酮酸激酶缺乏症的基因疗法。

发明背景

丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是由PKLR基因突变引起的单基因代谢疾病，其导致可变症状的溶血性贫血，并且在新生儿期可能是致命的。PKD隐性遗传性状及其通过同种异体骨髓移植的治愈性治疗为开发基因治疗方法提供了理想的方案。

在影响红细胞的许多其他遗传性酶缺乏中，丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是引起慢性非球形红细胞性溶血性贫血(chronic nonspherocytic hemolytic anemia，CNSHA)的最常见因素(Zanella等，2007)。PKD的发作和严重性变化很大，范围从轻微到严重的新生儿贫血，在最严重的病例中在童年期间变得致命(Pissard等2006)。新生儿期间的生长迟缓、胎儿水肿和死亡也以低频率有过报道(Gilsanz等，1993)。一般高加索人群中PKD患病率估计为1:20,000(Beutler等，2000)，到目前为止，在PKLR基因中已鉴定出超过195种不同的突变(http://www.lovd.nl/pklr)。同种异体骨髓移植(BMT)已被成功用于治愈严重PKD患者(Tanphaichitr等2000)，但组织相容性供体的低可得性和与这些患者的BMT相关的严重并发症(即移植物抗宿主病、机会性感染等)使得定期输血和脾切除术成为大多数PKD的严重形式的主要治疗选择(Zanella等2005)，这大大提高了患者的发病率和死亡率(Hilgard等2005)。对于严重PKD患者及其隐性遗传性状的治疗选择的有限功效和副作用使得PKD成为通过基因疗法治疗的合适疾病。

PKD是由丙酮酸激酶(PK)中的缺陷引起的(Zanella 2005)，该酶催化所有细胞中糖酵解途径的最后ATP产生反应。在成熟的红细胞中，PK变得必不可少，因为RBC仅表达R型特异性同种型(RPK)(Kanno等1992)，这归因于PKLR基因座的红系特异性替代启动子的调节(Noguchi等1987)。因此，任何RPK活性的丧失都会损害RBC代谢和寿命(Zanella 2005)，导致CNSHA。

治疗和预防遗传和其他疾病和病症的一种有希望的方法是用基因治疗载体递送治疗剂。目前，病毒载体在基因转移中表现出最大的效率，并且为了校正遗传疾病而使得需要持久的基因表达，疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或基于AAV的载体因病毒生命周期的整合性质而为理想的载体。

单基因疾病，特别是那些影响造血系统的疾病的基因疗法，已经提供了令人信服的证据，即自体造血干细胞(HSC)的遗传校正是对同种异体HSCT的替代治疗选择，避免了其主要并发症(Cartier等2009；Cavazzana-Calvo等2010；Cartier等2012；Aiuti等2013；Biffi等2013)。对影响红细胞的疾病(例如β地中海贫血和镰状细胞病)的遗传校正已在动物模型(Pestina等2009l Breda等2012)以及也在人(Cavazzana-Calvo等2010)中得到解决。然而，遗传性红系代谢缺陷诸如PKD的基因治疗方法仍然有限。已经在小鼠(Tani等1994；Meza等2009)和狗RPK缺陷型实验模型(Trobridge等2012)中证实了HSC基因疗法治疗PKD的可行性，鉴于缺乏供体基因校正的HSC的选择优势，这些实验结果显示了供体嵌合和转导水平是实现溶血表型的高效校正的关键点(Richard等，2004)。先前使用PKD小鼠模型的工作表明，当移植超过25％的遗传修正细胞时，逆转录病毒来源的人RPK表达能够完全校正PKD表型(Meza等2009)。最近在一只注入体内扩增和泡沫载体校正的HSC的PKD Basenji狗中报道了校正细胞的相似治疗阈值(Trobridge等，2012)。