[发明专利]用于合成和检测核酸的组合物、方法和试剂盒

说明书

本文提供用于合成、检测和/或定量核酸的组合物、方法和试剂盒。实施例包含核酸扩增组合物，其包含热稳定DNA聚合酶和改善粗提取物或粗裂解物样品中的核酸靶标的核酸合成、扩增、检测和/或定量的试剂。

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2016年4月6日提交的美国临时专利申请第62/319,151号的优先权的利益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本教导属于分子生物学和遗传分析的领域。本发明涉及可用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地说，提供了用于扩增、检测和/或定量核酸分子的组合物、方法和试剂盒，所述核酸分子尤其是那些具有低拷贝数(copy number)和/或如在粗裂解物中存在抑制物的情况下的核酸分子。

背景技术

在其最简单的形式下，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是用于使用两个寡核苷酸引物来酶促合成特异性DNA序列的体外方法，所述两个寡核苷酸引物与相对链杂交并位于靶DNA中的靶标区域的侧面。包括模板变性(templatedenaturation)、引物退火和DNA聚合酶延伸退火引物的一系列重复的反应步骤引起特异性片段的指数积累，所述特异性片段的末端由引物的5'端限定。PCR能够产生10⁹倍选择性富集的特异性DNA序列。参见例如美国专利第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159和第4,965,188，和Saiki等人，1985，《科学(Science)》230:1350。

市售PCR主混合物提高了效率并减小了与高通量分析所需的大量PCR反应的组装相关的误差。这些主混合物含有所有PCR反应共用的试剂的组合。举例来说，主混合物可以含有缓冲剂、盐如MgCl₂、脱氧核苷三磷酸(dNTP)和热稳定DNA聚合酶。主混合物通常作为浓缩溶液或冻干粉末来制造和分配，随后在组装最终反应时稀释或溶解。

对于准确的核酸分析，PCR主混合物应提供可靠的稳健的并且可重复的PCR结果。此外，PCR主混合物应允许检测低拷贝数靶核酸。举例来说，许多医学、诊断和法医应用依赖于样品中的特定DNA序列的扩增，在所述样品中序列以非常低的量存在。另外，许多这类应用依赖于从粗制或未纯化样品如细胞或组织粗裂解物的核酸序列的扩增。

因此，需要利用所有类型的核酸样品来可靠地发挥作用的PCR组合物，所述样品包括粗制样品制剂和/或那些具有少量靶标的样品。

发明内容

本文提供了用于通过聚合酶依赖性核酸合成(包括例如使用聚合酶链式反应(PCR))来合成、检测和/或定量核酸的组合物、试剂盒和方法。在一些实施例中，本文提供了包含DNA聚合酶、盐、消泡剂和dNTP与dNTP衍生物的组合的组合物。

在某些实施例中，本教导提供了包含热稳定DNA聚合酶的组合物。在一些实施例中，热稳定DNA聚合酶选自以下：Taq DNA聚合酶；Tne DNA聚合酶；Tma DNA聚合酶；Pfu DNA聚合酶；KOD DNA聚合酶；Tfl DNA聚合酶；Tth DNA聚合酶；Stoffel片段DNA聚合酶；VENT^TMDNA聚合酶；DEEPVENT^TMDNA聚合酶；和其突变体、变异体或衍生物。在一些实施例中，热稳定DNA聚合酶是Taq衍生的DNA聚合酶。

在某些实施例中，本教导提供了包含钾盐、镁盐和/或钠盐的组合物。在一些实施例中，盐浓度是约5mM到约200mM。