[发明专利]链霉亲和素突变蛋白及其使用方法

说明书

本发明涉及新的链霉亲和素突变蛋白及其在变性条件下用于纯化、分离或测定蛋白中的用途。在一个实施方案中，这种突变蛋白在链霉亲和素的野生型序列的序列位置127处具有Cys残基并在于野生型链霉亲和素氨基酸序列有关的氨基酸位置115至121的区域中具有至少一个突变。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年4月25日向欧洲专利局提交的欧洲专利申请16 166 773.8的优先权，所述专利申请的全部内容并入本文用于所有目的。

发明领域

本发明涉及新的稳定的链霉亲和素突变蛋白，利用重组DNA技术产生该突变蛋白的方法，以及这些链霉亲和素突变蛋白在变性条件下用于分离、纯化和测定生物物质(比如重组蛋白)中的用途。因此，本发明还涉及具有固定于其上的本发明的链霉亲和素突变蛋白的固相以及编码本发明突变蛋白的核酸分子。本发明进一步涉及适用于检测、分离或纯化蛋白的试剂盒，其包含本发明的突变蛋白，例如固定于固相上的本发明的突变蛋白。

背景技术

在大肠杆菌中许多重组蛋白的高水平表达导致形成高度聚集的蛋白，此类高度聚集的蛋白通常称为包涵体。包涵体通常在细胞质中形成。然而，当采用分泌载体时，包涵体也可在周质空间中形成。然而，包涵体不限于大肠杆菌；其也可以在例如酵母、哺乳动物和昆虫细胞中形成。若形成包涵体，则可以通过在纯化过程中使用比如6M盐酸胍(guanidinium hydrochloride)(也称为盐酸胍(guanidine hydrochloride))或8M尿素的变性条件来纯化携带多组氨酸亲和标签的融合蛋白(参见，例如PalmerWingfield“Preparation and Extraction of Insoluble Inclusion-Body Proteins fromEscherichia coli”，Curr Protoc Protein Sci.2004November；CHAPTER：Unit-6.3.doi：10.1002/0471140864.ps0603s38或BornholstFalke“Purification of Proteins UsingPolyhistidine Affinity Tags”，Methods Enzymol.2000；326：245-254)。亲和色谱介质与多组氨酸标签(比如六组氨酸(His₆)标签)的相互作用不需要肽标签的特定构象，这使得采用变性条件进行有效纯化成为可能。为此，Schmidt和Skerra认为，当在例如用于6M盐酸胍存在下自溶解的包涵体中分离重组蛋白时，His₆标签是比II更好的选择(SchmidtSkerra，“The strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.”Nature Protocols 2(2007)，1528-1535)。因此，当采用链霉亲和素结合亲和标签比如亲和标签时，建议将此类链霉亲和素结合亲和标签和His₆标签均融合到重组蛋白上，以能够首先通过His₆标签在变性条件下自包涵体纯化重组蛋白，并且在重新折叠蛋白质后，通过链霉亲和素结合肽在生理条件下进行第二次亲和纯化。这样做应该能够自包涵体获得高纯度和同质的蛋白质制剂。