[发明专利]植物甜蛋白的细胞外分泌方法

说明书

本发明公开了一种以提高的产率分泌植物甜蛋白的方法。

技术领域

本发明涉及提高产率和纯度的从大肠杆菌细胞的植物甜蛋白的细胞外分泌的方法。

背景技术

植物甜蛋白是一种高效能的热稳定甜蛋白，最初是从西非攀爬树Pentadiplandrabrazzeana Baillon的果实中分离出来的(Ming和Hellekant，FEBS Lett.355：106-108,1994)。与2％蔗糖水溶液相比，植物甜蛋白比蔗糖甜2500倍，与10％蔗糖相比，植物甜蛋白比蔗糖甜500倍。由于与其他基于蛋白质的天然甜味剂(例如奇异果甜蛋白(thaumatin)或应乐果甜蛋白(monellin))相比，其与蔗糖相近的味道特征、其水溶性、在高温和低pH下的稳定性，植物甜蛋白可方便地用于烘焙配方和被工业食品制造商使用。植物甜蛋白的这种稳定性及其甜味特征使其成为目前可获得的低卡路里高强度甜味剂(例如三氯蔗糖，阿斯巴甜和甜叶菊)的合适替代品。作为膳食蛋白质，糖尿病患者可以安全食用。当与其他甜味剂(如阿斯巴甜和甜叶菊)混合时，植物甜蛋白减少它们的余味并补充它们的风味。

然而，从其天然来源分离植物甜蛋白是昂贵的，因此在商业上不可行。此外，以生产植物甜蛋白而闻名的Pentadiplandra brazzeana(植物甜蛋白在种子周围的果肉的细胞外空间中被发现)在地理上位于西非地区的喀麦隆和加蓬，全球地从其他地区以商业规模分离植物甜蛋白变得不切实际。

鉴于从P.Brazzeana提取植物甜蛋白的方法产生的许多困难，本领域已经提出了几种合成方法来设计合成植物甜蛋白的机制。

在结构上，植物甜蛋白包含54个氨基酸残基，对应于6.5kDa的分子量，并且已经基于N-末端序列的变异进行了分类。I型植物甜蛋白是由54个氨基酸组成的不稳定形式，其具有谷氨酰胺作为第一个氨基酸。这种不稳定的形式可以转化为II型植物甜蛋白形式或主要形式(Major form)，其中N-末端位置的谷氨酰胺被转化为焦谷氨酸盐。在III型植物甜蛋白或次要形式(Minor form)中，在第一个氨基酸位置不存在谷氨酰胺，因此生成了53个氨基酸的氨基酸序列。(Assadi-Porter等，Arch.Biochem.Biophys.376：252-258,2000)。

除了这些天然存在的形式，研究人员已经开发出了植物甜蛋白的变体和多变体，它们在不同的温度和pH范围内具有优异的物理稳定性，并且通过某些位置的氨基酸的取代来使野生型植物甜蛋白突变而具有优异的味道特征。

美国专利No.8592181中的公开内容涉及具有更高甜度的植物甜蛋白变体和多变体，以及制备所述多变体的方法。为了提高重组可溶性植物甜蛋白的生产水平，由美国181的同一发明人提出的相应的研究论文(Kwang-Hoon Kong等,Bull.Korean Chem.Soc.2010，Vol.31,No.12)已经建立了使用来自欧文氏菌(Erwinia carotovora)CE的果胶裂解酶B的pelB前导序列进行植物甜蛋白表达的新策略。其中公开的植物甜蛋白表达的方法仅导致了蛋白质的周质定位。后发酵、下游加工技术涉及对诱导的BL21Star(DE3)细胞进行离心和渗压震扰(osmotic shock)。周质表达和渗透处理以分离蛋白质的主要缺点是其低表达产率、多个离心步骤和渗透处理过程中缓冲液体积的大量增加，使得分离过程繁琐并导致产量损失。

Fariba Assadi-Porter等人(Protein Expr Purif.2008Apr；58(2)：263-8)已尝试提供在大肠杆菌中植物甜蛋白的有效和快速的蛋白质表达和纯化。然而，其中描述的方法涉及与小泛素样修饰蛋白(Small Ubiquitin-like Modifier protein)(SUMO)融合的植物甜蛋白蛋白质的细胞内表达，然后通过SUMO蛋白酶切割。SUMO蛋白质是小蛋白质家族，其与细胞中的其他蛋白质共价连接和分离以改变其功能。然而，SUMO与植物甜蛋白蛋白质的融合不会改变植物甜蛋白向细胞外区域的定位，从而导致使用昂贵且不方便的下游处理来分离和纯化功能性蛋白质。