[发明专利]一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法

说明书

本发明公开一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤，接种病毒前首先对毒源病毒提纯，病毒的临时保存方法为病毒多角体配制成1.2×10⁴个/毫升～1.4×10⁴个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室温条件保存1～2小时，接种病毒的时间选择为家蚕五龄饷食后4～8小时，接种病毒后90～100小时采收病毒。本申请提供的扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，生产工艺简单，生产成本低，扩繁效益高，对环境的要求也低，是生产家蚕血液型脓病灭活疫苗首选的病毒扩繁方案。

技术领域

本申请涉及一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，属于灭活疫苗制备技术领域。

背景技术

灭活疫苗是指先对病毒或细菌进行培养，然后用加热或化学试剂(通常是福尔马林)将其灭活，从而得到的疫苗。目前，国内使用的灭活疫苗有百白破疫苗、流行性感冒疫苗、狂犬病疫苗和甲肝灭活疫苗等，在家畜及家禽生产方面，研发的灭活疫苗更是不计其数，为控制传染性疾病的流行，发挥了重要的作用。生产上病原的扩繁，一般采用先行繁殖宿主活体细胞，然后再人工接种病原，等到宿主细胞形态发生显著变化后再收获病原，因此，病原的大规模扩繁是灭活疫苗生产的前提条件。

家蚕血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒侵染引起的急性传染病，生产上，其发病急，传染快，损失大，一般可引起20％左右的产量损失，重灾农户甚至可导致颗粒无收。对家蚕血液型脓病的防治，目前主要采用的以消毒防病为主的预防措施，也有科研部门研发其灭活疫苗，取得了一些进展。对于家蚕核型多角体病毒，中国专利CN1410541A公开了可用克隆的昆虫卵巢细胞进行扩繁，存在着生产场所条件要求高，生产工艺繁杂，生产成本高的缺陷，直接进行家蚕活体接种进行病毒扩繁，成为优先采用的手段。在用教科书《蚕病学》(浙江省嘉兴农业学校主编，农业出版社，1995年5月出版)中公开的方法进行人工接种扩繁病毒时，存在着家蚕细菌性病害发病率高、真菌性病害发病率高、病毒性病害发病率低的现象，进而导致扩繁效率低下。本发明提出了一种新的家蚕核型多角体病毒的人工扩繁方法，旨在为进一步研发家蚕血液型脓病灭活疫苗打下基础。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，采取的技术方案是：

一种扩繁家蚕核型多角体病毒的方法，包括毒源病毒的制备、病毒的临时保存、病毒的人工接种、病毒的采收几个步骤，其特征是：病毒的临时保存方法为病毒多角体配制成1.2×10⁴个/毫升～1.4×10⁴个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶0.8～1.2∶0.8～1.2的配比，24～26℃室温条件保存1～2小时。

进一步的优选方案是：病毒的保存方法为病毒多角体配制成1.3×10⁴个/毫升浓度，按病毒液∶10％氟派酸∶10％多菌灵，1∶1∶1的配比，25℃室温条件保存1.5小时。

所述毒源病毒的制备包括以下步骤：病蚕收集、研磨、双层纱布过滤、离心提纯，具体为，病蚕的收集为选取家蚕血液型脓病典型症状的体节肿胀，血液呈乳白色的蚕儿，经1％有效氯漂白粉水溶液体表消毒后放入粉碎机中，加入等量的无菌水磨碎，再后用双层纱布过滤，滤去杂质，滤液移入离心机中，3500转/分的转速离心5分钟，倒掉上层澄清液，取下层沉淀，加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，再倒掉上层澄清液，取下层沉淀，再加入5倍的无菌水混合均匀，再离心5分钟，倒掉上层澄清液，最后显微镜检查多角体密度，配制成1.2×10⁴个/毫升～1.4×10⁴个/毫升浓度备用。

所述病毒的人工接种方法为穿剌接种，接种时，取接种针先进行酒精灯火焰灼烧消毒，再用接种针醮取病毒临时保存液，沿与家蚕身体长度平行方向，从倒数第二腹节的节间膜处，由后往前，剌穿家蚕体壁，接种时间选择在家蚕五龄饷食后4～8小时。