[发明专利]一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法

权利要求书

1.一种双波长共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)绘制ΔI和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线：向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mL缓冲溶液，1.0mL浓度为1.0×10^-3mol/L的亮蓝溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F-2500型荧光分光光度计上，以λ_ex＝λ_em进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝345nm处体系的共振散射强度值I₁，其中试剂空白在λ＝345nm处体系的共振散射强度值I₀₁，并计算ΔI₁＝I1-I₀₁；同时记录含壳聚糖的各检测体系在次大共振瑞利散射波长λ＝445nm处共振瑞利散射强度I₂和空白试剂的共振瑞利散射强度I₀₂，计算共振瑞利散射强度差值ΔI₂＝I₂-I₀₂，其中ΔI＝ΔI₁+ΔI₂；建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；

2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液；用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液；

3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔI和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔI和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；

4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在波长345nm和445nm处测定其共振瑞利散射强度差值ΔI₁和ΔI₂，并计算ΔI＝ΔI₁+ΔI₂，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验；

所述缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液的pH为3.0；步骤1中试剂的加入顺序为首先加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，其次加入亮蓝溶液，再次加入十二烷基硫酸钠阴离子表面活性剂溶液，最后加入壳聚糖溶液；步骤1)中壳聚糖的浓度范围是0.005-1.8μg/mL。